【摘要】：目的:瘧疾是一種經按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的全球性蟲媒傳染病,約34億人存在著感染的風險,目前仍有九十多個國家存在著瘧疾,腦瘧是瘧疾最嚴重的并發(fā)癥。在撒哈拉以南非洲地區(qū)兒童發(fā)病率及病死率高,營養(yǎng)不良被公認是其重要的影響因素之一。近來的研究表明,維生素D(Vitamin D,VD)不足在非洲地區(qū)是一個常見的營養(yǎng)不良問題,公眾會誤認為VD的缺乏應該只發(fā)生在赤道南北緯35度以上的區(qū)域范圍,而在非洲地區(qū)生活的人群多靠近赤道,由于得到充足的光照,不會存在VD不足的情況。但現(xiàn)實的研究表明,即使在日照充足的地區(qū),也存在著VD缺乏的問題。除了光源性維生素D來源外,食源性維生素D的缺乏可能是另一個重要的因素�；加兄匕Y瘧疾兒童的血清VD水平顯著低于健康人群的兒童。目前越來越多的科研工作者開始關注維生素D的基礎研究,認為其可以通過調節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮其抗感染作用。人類腦型瘧疾的分子及細胞機制主要包括促炎細胞因子表達水平的上升、NF-κB通路引起內皮激活導致細胞粘附因子的上調,神經膠質細胞活化及感染紅細胞、單核細胞、血小板在腦毛細血管的隔離。近來有研究發(fā)現(xiàn)鈣三醇在體外具有抗瘧疾能力。有研究報告稱,在感染伯氏瘧原蟲的小鼠中,感染后治療性使用維生素D可使小鼠感染腦型瘧疾的感染率和死亡率降低。為此,我們根據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織(Food and agriculture organization of the united natio,FAO)數據庫、美國農業(yè)部數據庫(United States Department of Agriculture,USDA)、全球疾病負擔網站(Global Burden of Disease,GBD),系統(tǒng)地進行了非洲38個國家主要的7種食物消費維生素D水平與非洲瘧疾病死率(Death)、傷殘調整生命年(Disability Adjusted of Life,DALY)、死亡損失壽命年(Years of Life Lost,YLL)、傷殘損失壽命年(years lived with disability,YLD)關系的研究;預防性補充VD對實驗腦瘧模型(Experimental cerebral malaria,ECM)的免疫調節(jié)效應及其相關機制和VD對巨噬細胞RAW264.7的免疫調節(jié)效應及其相關機制研究,旨在為瘧疾的有效防治提供新的理論依據,從而制定更為有效的抗瘧策略。研究方法:1.非洲撒哈拉以南38個國家食物消費維生素D水平計算非洲38個國家7種食物成分中VD含量,得出各國食物消費量日人均維生素D量。以此與各國瘧疾DALY進行相關分析,并分為高低劑量組進行比較分析。2.小鼠感染及原蟲血癥觀察通過腹腔注射1×10~6P.b ANKA寄生的紅細胞(pRBC)感染小鼠,感染后每日取尾靜脈血涂片,Giemsa染液染色,鏡檢計數紅細胞感染率。每日觀察小鼠的生存情況和狀態(tài),以及是否患有腦瘧。3.小鼠VD處理C57BL/6小鼠隨機分為4組,分別為正常小鼠未感染組(uninfected),PbA感染組(PbA),PbA感染對照組(油+PbA),Pb感染前預防性補充VD組(VD+PbA)。Pb感染前預防性補充VD組(VD+PbA)在小鼠感染PbA前五天起每日灌胃給予VD(50μg/kg),同時,PbA感染對照組(油+PbA)在VD給藥相同時間點給予相同體積的大豆油。4.小鼠血腦屏障通透性檢測小鼠感染第五天后各組取小鼠尾靜脈注射200μl2%伊文思藍染料。一小時后,心臟灌注生理鹽水,處死小鼠后立即取腦并拍照。將小鼠的腦放入離心管中,每管加入2ml甲酰胺,孵育后離心,取上清液200μl,置于96孔板中,檢測波長為630nm的吸光度并計算EB含量。5.巨噬細胞RAW264.7體外培養(yǎng)實驗分為四組,分別為只加入培養(yǎng)基的Normol組;只加入有效濃度VD的VD組(濃度為10nM);只加入LPS(1μg/ml)的LPS組為對照組;實驗組VD+LPS組中每孔分別加入10nM的VD,再加入1μg/ml的LPS。每組設置2個復孔,培養(yǎng)48小時后分別收上清及細胞。6.RNA提取及Real-time RT-PCR取腦、脾及巨噬細胞RAW264.7提取RNA,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒去除殘存的基因組DNA后,將RNA反轉錄合成cDNA。用得到的cDNA產物作為模板,進行RT-qPCR反應。采用2~(-ΔΔCT)法量化各個分組的相對基因表達情況。7.ELISA檢測取小鼠血清、脾培養(yǎng)上清、腦、巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(RD Systems,Minneapolis,MN,USA)進行檢測。按照試劑盒說明書進行操作。8.流式細胞術制備小鼠脾細胞、腦細胞、巨噬細胞單細胞懸液,染色后用流式細胞儀進行檢測,Flowjo軟件分析。9.統(tǒng)計學分析所有數據均以均數±標準差(x±s)表示,多組間數據用Prism7統(tǒng)計軟件進行多組均數的單因素方差分析(ANOVA),組間比較用q檢驗,標本采用獨立樣本t檢驗比較分析組內和組間均值差異,采用Kaplan Meyer方法進行生存期分析。P0.05為顯著差異。結果:1.非洲兒童處于維生素D嚴重不足的狀態(tài)非洲38個國家平均食物消費維生素D水平很低。各國平均食物消費維生素D與DALY、Death、YLL具有顯著負相關。30國家維生素D平均值低于2μg(80IU)/day以下,遠低于WHO推薦水平。只有8國高于5μg/day。以此將各國維生素D劃分兩組進行比較分析,DALY、YLL和YLD均具有顯著性差別。2.預防性補充顯著升高P.bANKA感染C57BL/6小鼠血清中25(OH)D_3水平感染后第5天,處死小鼠取血清檢測小鼠血清中VD含量。結果顯示,PbA感染組(PbA)及預防性使用VD組(VD+PbA)的小鼠VD水平可見顯著差異,且個體之間差異較大。3.預防性補充VD顯著防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的發(fā)生PbA感染組與PbA感染對照組(油+PbA)在小鼠癥狀、生存期、腦瘧發(fā)生率、原蟲血癥等方面并無差異,但與預防性補充VD組(VD+PbA)相比,在各方面均可見顯著差異。4.預防性補充VD顯著改善實驗性腦瘧的病理改變PbA感染組(PbA)血腦屏障完整性明顯破壞,有很明顯的EB外滲,預防性補充VD組(VD+PbA)只可見少量EB外滲。5.預防性補充VD可顯著減少T細胞向腦組織遷移感染第5天,兩組小鼠腦組織的CXCR3、CXCL9和CXCL10均可見明顯升高。預防性補充VD組(VD+PbA)顯著降低了腦組織中趨化因子CXCR3、CXCL9及CXCL10的表達。6.預防性補充VD抑制Th1細胞免疫應答,降低IFN-γ、TNF-α水平預防性補充VD組(VD+PbA)小鼠脾細胞中Th1型細胞所占比例明顯降低。在血清及脾培養(yǎng)上清中,感染后第5天,預防性補充VD組(VD+PbA)的IFN-γ和TNF-α表達量與PbA感染組(PbA)相比顯著降低。與PbA感染組(PbA)相比,預防性補充VD組(VD+PbA)小鼠脾細胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA表達水平及小鼠腦細胞IFN-γ和TNF-α的mRNA表達水平亦可見明顯的降低。7.預防性使用VD提高Tregs數量并增加IL-10、TGF-β分泌感染第3天,預防性補充VD組(VD+PbA)脾細胞中Tregs的數目明顯低于PbA感染組(PbA)脾細胞中Tregs的數目。與PbA感染組(PbA)相比,預防性補充VD組(VD+PbA)小鼠血清TGF-β及脾培養(yǎng)上清IL-10及TGF-β的水平在感染后第5天顯著高于PbA感染組(PbA)。8.預防性使用VD抑制DC的分化、成熟及活化在小鼠感染后第5天,PbA感染組(PbA)髓樣DCs(mDCs)和漿樣DCs(pDC)數量及比例略高于預防性補充VD組(VD+PbA),與PbA感染組(PbA)相比,預防性補充VD組(VD+PbA)DCs共刺激分子MHC-II的比例表達略有降低。9.預防性使用VD抑制分泌IL-1、IL-6、IL-12數據顯示,在感染PbA第3、5天,與PbA感染組(PbA)相比,預防性補充VD組(VD+PbA)血清、脾上清的IL-1、IL-6、IL-12水平及脾IL-1、IL-6、IL-12的mRNA表達水平均有明顯的減少。對體外巨噬細胞RAW264.7的刺激也顯示出相似的結果。10.預防性使用VD抑制NF-κB表達預防性補充VD組(VD+PbA)脾細胞NF-κB的mRNA表達水平顯著減少。11.VD可抑制巨噬細胞RAW264.7 TLR4、TLR9及CD40的表達與LPS組相比,VD+LPS組CD40、TLR4、TLR9表達水平明顯下降,預防性補充VD組(VD+PbA)TLR4及TLR9的mRNA表達水平與LPS組相比顯著下降。12.VD可抑制巨噬細胞RAW264.7 Th1型炎癥因子的釋放VD+LPS組TNF-α的表達水平與LPS組相比明顯降低。除此之外,VD+LPS組的TNF-α的mRNA表達水平顯著降低。13.VD可抑制巨噬細胞RAW264.7對淋巴細胞的刺激作用流式細胞術結果表明,LPS刺激可使巨噬細胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表達水平顯著上升,發(fā)現(xiàn)CD80、CD86的表達水平VD+LPS組與LPS組相比明顯降低,預防性補充VD組(VD+PbA)MHC-II的mRNA表達水平與LPS組有顯著下降。結論:非洲38個國家來自食物消費的人均維生素D水平很低,平均值也僅僅是可達4μg/日人均消費維生素D。而30個國家的日人均消費維生素D不足2μg(80IU)以下。遠低于WHO推薦的5μg(200IU)和美國醫(yī)學研究院推薦1-70歲人群的維生素D每日攝入量為15μg(600 IU),70歲及以上為20μg(800IU)。這足以證明,在非洲兒童處于維生素D嚴重不足的狀態(tài)。我們對維生素D與DALY的研究結果表明,維生素D是瘧疾的保護因素。預防性補充VD可顯著防止P.b ANKA感染的C57BL/6小鼠CM的發(fā)生,降低小鼠的死亡率,改善實驗性腦瘧的病理改變。VD可抑制DC的分化、成熟及活化,影響脾臟DCs數量,減少巨噬細胞RAW264.7 CD80、CD86、MHC-II分子表達,進而抑制巨噬細胞RAW264.7的抗原提呈功能。VD還可抑制巨噬細胞RAW264.7TLR4、TLR9及CD40的表達,減少NF-κB通路的作用,并抑制巨噬細胞分泌IL-1、IL-6、IL-12及Th1型炎癥因子TNF-α,進一步減少抗原提呈細胞對淋巴細胞的刺激作用。預防性補充VD可抑制Th1細胞免疫應答,提高Tregs數量并增加IL-10、TGF-β分泌,抑制炎癥反應的發(fā)生。除此之外,預防性使用VD抑制NF-κB表達,也可進一步抑制炎癥反應。從而減少腦中趨化因子CXCL9、CXCL10和粘附分子ICAM-1、VCAM-1,的表達,進而降低CD8~+T細胞在腦中的積聚,改善血腦屏障的完整性,最終防止腦瘧的發(fā)生。
【圖文】：

圖 1 非洲 38 個國家 7 種食物累加日人均維生素 D 經年變化示 Congo 等 8 個國家的日人均 VD 量較高，均在 4μg 以上，其中 Gabon 最高，其高達 10μg；Namibia 等 30 個國家的日人均 VD 量偏低，均在 4μg 以下，其中 Sier3 年開始呈上升趨勢。為了清晰地描述非洲 38 個國家食物消費維生素 D 集中水平國食物消費維生素 D 水平所在年份升序排列（不擴展），再將 38 個國家按 8 和求各組均值，，產生圖 2。

圖2兩組不同食物消費維生素D水平經年Y 化
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 馬曉峰;劉曉菊;曾曉麗;;維生素D對慢性阻塞性肺疾病的影響[J];中國老年學雜志;2014年11期

2 Xiao-Rong Xu;Chang-Qin Liu;Bai-Sui Feng;Zhan-Ju Liu;;Dysregulation of mucosal immune response in pathogenesis of inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年12期

3 宋淑軍;劉俊麗;徐冰心;王曉菲;王宗燁;譚小青;司少艷;;維生素D對糖皮質激素免疫抑制模型小鼠免疫功能的影響[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年23期

4 關莎莎;劉全忠;;維生素D_3的作用機制及在抗感染中的作用[J];皮膚性病診療學雜志;2011年03期

5 吳革平;章如新;;三種脂溶性維生素的免疫調節(jié)作用及其研究進展[J];國際免疫學雜志;2008年02期

6 盧航青;鄭杰;;全反式維甲酸和1α,25二羥維生素D_3對肝癌細胞HepG2生長的協(xié)同抑制作用[J];癌癥;2006年12期

7 祁曉平;黎介壽;李培;李剛;孫正;吳曉宇;;1,25-二羥維生素D_3對Th1優(yōu)勢應答大鼠免疫功能的影響[J];解放軍醫(yī)學雜志;2006年11期

8 黃愛萍;維生素D缺乏性佝僂病的免疫功能研究[J];實用兒科臨床雜志;1996年02期

本文編號：2618360