【摘要】：【背景】骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植療法因有望修復心肌梗死導致的受損心肌組織而成為研究熱點。梗死區(qū)域的組織微環(huán)境因缺血缺氧誘發(fā)氧化應激反應不利于移植BMSCs存活,從而限制了BMSCs的療效。研究發(fā)現(xiàn),脯氨酸羥化酶2(Prolyl hydroxylase 2,PHD2)和缺氧誘導因子1α(Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)是調控細胞在缺氧環(huán)境中存活的重要物質。PHD2是HIF-1α的負性調節(jié)因子。在常氧狀態(tài)下,PHD2通過羥化作用降解HIF-1α;在缺氧狀態(tài)下,PHD2失活,HIF-1α豐度增高。HIF-1α可作為轉錄因子被轉運至細胞核中參與調節(jié)細胞在缺氧狀態(tài)下的代謝增殖等細胞活動,提示沉默PHD2可能對氧化應激環(huán)境中的MSC具有保護作用。【目的】本研究旨在通過shRNA-PHD2修飾BMSCs,探究沉默PHD2表達對BMSCs耐受氧化應激損傷的作用�！痉椒ā咳撬栀N壁法提取SD大鼠BMSC;構建帶有目的基因PHD2-shRNA的慢病毒載體系統(tǒng)并轉染BMSCs,篩選出穩(wěn)定表達PHD2-shRNA的BMSCs群(shPHD2-MSC);構建體外氧化應激損傷模型,將實驗細胞分為MSC組,MSC+H2O2組,shPHD2-MSC+H2O2組,為模擬HIF-1α作用失活,再添加shPHD2-MSC+H2O2+YC-1實驗組。光鏡觀察MSC形態(tài)及分布。流式細胞術檢測MSC表面特異性CD分子。油紅染色分析BMSC定向成脂分化,茜素紅染色分析成骨分化。RT-PCR檢測細胞中PHD2和HIF-1α的mRNA表達,Western blotting檢查技術檢測細胞中PHD2和HIF-1α的蛋白表達。TUNEL染色和Annexin VAPC/7-AAD雙染色法流式檢測細胞凋亡。【結果】1.光鏡下觀察MSC呈長梭形,以旋渦或者平行狀排列生長。2.流式細胞學分析結果顯示MSC表面CD分子表達情況分別為:CD29(91.27%),CD90(92.04%),CD45(0.45%),CD34(0.04%)。3.油紅染色BMSC定向成脂分化結果顯示,BMSCs分化成的脂肪細胞中脂滴飽滿且可被油紅染色為紅色。茜素紅染色BMSC定向成骨分化結果顯示,BMSCs分化成的骨細胞中的鈣化結節(jié)和細胞間的鈣鹽沉積可被茜素紅染成紅色。4.RT-PCR檢測結果顯示,與MSC組比較,shRNA-MSC組中,PHD2的m RNA表達降低,而HIF-1α的mRNA表達升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。Western blotting檢測蛋白表達結果趨勢與RT-PCR結果趨勢一致,與MSC組比較,shRNA-MSC組中,PHD2的蛋白表達降低,而HIF-1α的蛋白表達升高,數(shù)值差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5.TUNEL染色檢測結果顯示,與MSC+H2O2組比較,shPHD2-MSC+H2O2組細胞凋亡數(shù)量明顯減少,數(shù)值差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。6.Annexin V-APC/7-AAD雙染色法流式結果與TUNEL染色結果一致,與MSC+H2O2組比較,shPHD2-MSC+H2O2組細胞凋亡數(shù)量明顯減少,兩組凋亡率的差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05);而shPHD2-MSC+H2O2+YC-1組細胞凋亡數(shù)量明顯多于shPHD2-MSC+H2O2組,兩組數(shù)值差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。【結論】沉默PHD2的表達能明顯減少氧化應激環(huán)境中MSC的凋亡率,并且主要依賴受PHD2調節(jié)的HIF-1α作用,該研究為解決干細胞治療心梗面臨的細胞定植率等問題提供了體外研究的基礎。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文結 果1 骨髓間充質干細胞的形態(tài)、表型和功能鑒定1.1 光鏡下觀察 BMSC 形態(tài)收集骨髓腔沖洗液中的細胞種在 25cm2，，24h 后半定量換液，約兩至三天可見長梭形細胞貼壁生長，培養(yǎng)七天左右與可見長梭形細胞呈旋渦狀或放射狀成片生長，形成明顯的細胞集落（見圖 1A）。第一代和第二代細胞生長狀態(tài)最佳，增殖速度快，細胞形態(tài)多呈紡錘形（見圖 1B 和圖 1C），傳代至第三代的細胞形態(tài)無明顯改變，貼壁細胞融合度達 80%左右時，可見細胞分布規(guī)則，多為平行或旋渦狀走形（見圖 1D）。

流式細胞技術檢測MSC胞膜表面特異性CD分子
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R542.22;R-332

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本文編號：2618209