【摘要】：目的:初步分析野生型斑馬魚中brd4基因的時(shí)空表達(dá)情況。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立的可穩(wěn)定遺傳的brd4基因靶向敲除的斑馬魚突變體來探討brd4基因在斑馬魚胚胎髓系造血分化中的作用。同時(shí),利用BRD4蛋白的特異性小分子抑制劑JQ1處理野生型斑馬魚胚胎以進(jìn)一步驗(yàn)證brd4基因的作用,為理解brd4基因在造血發(fā)育及調(diào)控中的作用提供理論依據(jù)。方法:(1)基于斑馬魚brd4 mRNA CDS編碼區(qū)設(shè)計(jì)并構(gòu)建合成反義的RNA探針,運(yùn)用整胚原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)(WISH)和RT-PCR分析brd4基因在野生型斑馬魚體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)。(2)通過提取斑馬魚的基因組DNA和RNA、PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序和RT-PCR等多種方法鑒定brd4基因敲除斑馬魚突變體。(3)使用小分子抑制劑JQ1處理野生型斑馬魚胚胎,進(jìn)一步驗(yàn)證brd4在髓系分化中的作用。(4)通過蘇丹黑B染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成熟中性粒細(xì)胞的數(shù)量和分布。(5)通過中性紅活體染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的數(shù)量和分布。(6)利用整胚原位雜交(WISH)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)髓系造血特異性標(biāo)記基因mpx、lyz、l-plastin、mfap4的時(shí)空表達(dá)水平。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建brd4 mRNA分子探針,brd4基因?yàn)槟赶颠z傳,早期呈廣泛和非特異性地表達(dá);(2)與野生型和雜合突變斑馬魚相比,brd4~(-/-)斑馬魚通常在13dpf左右死亡,存活率的下降表明brd4基因在斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用;(3)通過T7轉(zhuǎn)錄酶體外轉(zhuǎn)錄cDNA,成功制備了斑馬魚粒系、單核巨噬系分化標(biāo)記基因的反義RNA探針,且具有良好的特異性;(4)蘇丹黑B染色(SBB)檢測(cè)到brd4~(-/-)的成熟中性粒細(xì)胞數(shù)量上的顯著減少,而中性紅活體染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到brd4~(-/-)的巨噬細(xì)胞數(shù)目與野生型斑馬魚相比無明顯差異;(5)整胚原位雜交(WISH)檢測(cè)brd4~(-/-)斑馬魚的粒系相關(guān)基因mpx、lyz的表達(dá)水平與野生型斑馬魚相比明顯下調(diào),而單核系基因l-plastin、mfap4的表達(dá)水平無明顯差異。(6)JQ1小分子抑制劑處理后的WT斑馬魚的表型分析結(jié)果與以上結(jié)果一致。結(jié)論:敲除brd4基因和JQ1藥物持續(xù)處理后均導(dǎo)致斑馬魚中性粒細(xì)胞的分化發(fā)育阻滯和數(shù)量上的明顯減少而不影響單核巨噬細(xì)胞的分化發(fā)育,提示brd4基因?qū)φＡ＜?xì)胞造血分化至關(guān)重要,其具體詳盡的分子調(diào)控機(jī)制及功能尚需進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 2. 斑馬魚早期發(fā)育過程中 brd4 的整胚原位雜交結(jié)果：0.75h,3h,4.7h,6h,12h,24h,48h,72h 分別代表斑馬魚單細(xì)胞受精后 0.75,3,4.7,6,12,24,48,72 小時(shí)后 brd4 的 mRNA 表達(dá)圖。3.brd4 基因在野生型成年斑馬魚組織器官中的表達(dá)分析在研究 brd4 基因在野生型成魚臟器中的表達(dá)情況時(shí)，我們通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn)對(duì)野生型斑馬魚的 7 個(gè)臟器組織進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，7 個(gè)檢測(cè)的臟器組織均有 brd4 基因的表達(dá)。其中，肌肉和腦的表達(dá)最高，脾臟和腎臟的表達(dá)最低，其余臟器如心臟、肝臟和卵巢的表達(dá)處于中間狀態(tài)（如圖 3 所示）。

年斑馬魚各組織器官中 brd4 基因的表達(dá)情況。 基因敲除斑馬魚突變體的敲除有效性分析rd4 基因發(fā)生移碼突變的斑馬魚品系 M1 的靶位點(diǎn) DNA 突變情況如接下來，我們將野生型斑馬魚與可導(dǎo)致 brd4 基因閱讀框發(fā)生改變的成魚交配，并把得到的 F2 代胚胎飼養(yǎng)至一個(gè)月左右時(shí)檢測(cè)基因型代 brd4 雜合子成魚自交產(chǎn)卵后得到了一批 F3 代斑馬魚。根據(jù)孟德，我們預(yù)計(jì) F3 代中應(yīng)該有 1/4 比例的 brd4 敲除型純合突變體，14 雜合子和 1/4 比例的野生型斑馬魚。然而，對(duì)生長(zhǎng)至 1 個(gè)月時(shí)期的剪尾鰭做基因型鑒定后，我們并未篩選到 brd4 基因敲除的純合突面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，與野生型或雜合突變型斑馬魚相比，brd活率下降，且通常在幼魚期 13dpf 左右時(shí)死亡。們首先通過異源雙鏈泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)在 DNA 水平上對(duì)該突變品系的靶向了驗(yàn)證。電泳結(jié)果顯示，，以雜合子斑馬魚的基因組 DNA 為模板擴(kuò)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R394

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本文編號(hào)：2616541