【摘要】：人副流感病毒3型(Human Parainfluenza Virus Type 3,HPIV3)屬于副粘病毒科,它與我們所熟知的水泡型口炎病毒、呼吸道合胞體病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒、麻疹病毒等都屬于不分節(jié)負(fù)義RNA病毒。HPIV3主要通過(guò)空氣傳播,感染呼吸道肺上皮細(xì)胞,引起嬰幼兒的急性呼吸道疾病,如肺炎、支氣管炎等。目前并沒(méi)有研發(fā)出針對(duì)HPIV3可用于臨床的有效疫苗和抗體,因而對(duì)HPIV3分子機(jī)制,致病機(jī)理等的深入研究對(duì)于人類及早攻克這類病毒有著重要意義。病毒感染通常會(huì)激活宿主細(xì)胞的壓力應(yīng)答反應(yīng),例如激活細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞形成應(yīng)激顆粒(Stress Granules,SGs)等。我們的研究發(fā)現(xiàn),HPIV3感染會(huì)激活宿主細(xì)胞中PKR的自磷酸化,并誘導(dǎo)其下游底物eIF2a的磷酸化。磷酸化的eIF2a無(wú)法參與到tRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)中,因而導(dǎo)致大量mRNA的翻譯無(wú)法順利進(jìn)行,停止在翻譯起始階段。這些翻譯起始被抑制的mRNP復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中大量積累,并逐漸形成SGs。HPIV3感染宿主細(xì)胞后開(kāi)始進(jìn)行復(fù)制轉(zhuǎn)錄,一方面表達(dá)大量的病毒蛋白,另一方面形成大量的病毒RNA。我們的研究發(fā)現(xiàn)這些病毒RNA是其誘導(dǎo)細(xì)胞形成SGs的關(guān)鍵因素,病毒RNA被宿主細(xì)胞的PKR所識(shí)別,并激活PKR/eIF2a的磷酸化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞形成SGs。通過(guò)RNAFish實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),HPIV3感染誘導(dǎo)細(xì)胞形成的SGs可以捕獲病毒的mRNA,抑制病毒蛋白的翻譯,從而抑制HPIV3的復(fù)制與傳播。我們通過(guò)沉默G3BP的表達(dá)來(lái)破壞SGs的形成,可以明顯增強(qiáng)HPIV3病毒蛋白的表達(dá)和病毒的復(fù)制。從而證明HPIV3感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞形成SGs,并且這種SGs具有抗病毒功能,可以抑制病毒的復(fù)制及其病毒蛋白的表達(dá)。為了完成自身的復(fù)制,不同的病毒通常會(huì)進(jìn)化出各種各樣的機(jī)制來(lái)逃逸宿主的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)。HPIV3與其它多種NNSRNA病毒一樣,感染宿主細(xì)胞后會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中形成一種包涵體(Inclusion Bodies,IBs)結(jié)構(gòu),通常認(rèn)為病毒的包涵體是病毒的復(fù)制工廠,主要參與完成病毒RNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。除此之外,包涵體也可能參與調(diào)控宿主細(xì)胞的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)HPIV3的包涵體可以參與調(diào)控SGs的形成。當(dāng)我們過(guò)表達(dá)HPIV3野生型的N和P蛋白時(shí),在細(xì)胞中形成大量的包涵體,這些包涵體可以明顯抑制HPIV3感染誘導(dǎo)的SGs的形成,然而對(duì)AS刺激,pIC和RNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的SGs的形成沒(méi)有明顯影響,這表明HPIV3的包涵體可以特異性的抑制其病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞形成SGs。N蛋白的478位亮氨酸使其與P形成包涵體的關(guān)鍵位點(diǎn),當(dāng)將的點(diǎn)突變NL478A與P共表達(dá)時(shí),不再能形成包涵體結(jié)構(gòu),因而也無(wú)法再抑制HPIV3感染誘導(dǎo)細(xì)胞形成SGs,這表明HPIV3的包涵體結(jié)構(gòu)對(duì)于其抑制SGs的形成至關(guān)重要。通過(guò)RNAFish實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),HPIV3野生型的N和P形成包涵體可以很好地結(jié)合病毒的RNA,而N的截短突變體NAN10雖然也可以與P形成包涵體,但是其結(jié)合病毒RNA的能力明顯下降,并且也不再抑制HPIV3感染誘導(dǎo)的SGs的形成,這表明HPIV3包涵體抑制其病毒感染誘導(dǎo)SGs的形成與其結(jié)合病毒RNA的能力有關(guān)。本研究闡明了 HPIV3誘導(dǎo)細(xì)胞形成抗病毒SGs的分子機(jī)制,并首次發(fā)現(xiàn)了病毒包涵體參與調(diào)控SGs形成的新功能。
【圖文】：

種認(rèn)為翻譯起始被抑制的ＲＮＰｓ復(fù)合物先寡聚成核，隨著ＲＮＰｓ復(fù)合物的增多逡逑逐漸變大形成ＳＧｓ的內(nèi)核，多個(gè)內(nèi)核相互融合并招募外殼形成成熟的ＳＧｓ。另逡逑一種則認(rèn)為翻譯起始被抑制的ＲＮＰｓ復(fù)合物先寡聚化形成分離相的液滴，然后逡逑隨著ＲＮＰｓ復(fù)合物的增多而變大，最后由于液滴中蛋白濃度的升高而逐漸形成逡逑ＳＧｓ的內(nèi)核。ＴＩＡ１／ＴＩＡＲ和Ｇ３ＢＰ在ＳＧｓ的組裝過(guò)程中起著重要作用，過(guò)表達(dá)逡逑這些蛋白可以促進(jìn)３0３自發(fā)組裝（１＇0１１１＾％１＾１３１．，２００３）。過(guò)表達(dá)�。В卑耍钡�？１１０逡逑結(jié)構(gòu)域可以抑制ＳＧＳ的組裝（Ｇｉｌｋｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。敲除ＭＥＦ細(xì)胞中的ＴＩＡ－１或逡逑者ＴＩＡＲ蛋白極大地削弱了該細(xì)胞形成ＳＧｓ的能力（Ｇｉｌｋｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００４）。沉默逡逑Ｇ３ＢＰ的表達(dá)或者過(guò)表達(dá)Ｇ３ＢＰ中富含ＰｘｘＰ的結(jié)構(gòu)域也可以抑制ＳＧｓ的組裝過(guò)逡逑程（Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅ，Ｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３）。Ｇ３ＢＰ的磷酸化也參與調(diào)控ＳＧｓ的組裝，當(dāng)過(guò)表逡逑達(dá)一種模擬Ｇ３ＢＰ磷酸化的突變體Ｇ３ＢＰＳ１４９Ｅ也會(huì)抑制ＳＧｓ的組裝（Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅ，，逡逑Ｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３邋）。逡逑（Ａ）邐Ｃｏｒｅｓ邋ｆｉｒｓｔ邋■邋＿邋Ｓｈｅｌｌ逡逑

圖１．５邋■一些病毒抑制ＳＧｓ形成的模式圖逡逑４．３邋—些病毒整個(gè)感染過(guò)程中都不抑制ＳＧｓ的形成逡逑隨著長(zhǎng)時(shí)間地進(jìn)化，有些病毒可以誘導(dǎo)ＳＧｓ的生成，并且在其整個(gè)感染過(guò)逡逑程中都不抑制ＳＧｓ的形成，其中一些病毒反而可以利用ＳＧｓ或者ＳＧｓ中的一些逡逑組分幫助病毒完成復(fù)制轉(zhuǎn)錄。逡逑有研究表明ＲＳＶ可能利用ＳＧｓ抑制宿主細(xì)胞的蛋白翻譯，從而能獲得更多逡逑的資源幫助病毒自身完成復(fù)制。用ＲＳＶ感染Ｈｅｐ－２細(xì)胞，２４邋ｈ后收樣，大約有逡逑３０％的細(xì)胞中形成ＳＧｓ，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在形成有ＳＧｓ的細(xì)胞中，逡逑ＲＳＶ的包涵體比沒(méi)有ＳＧｓ的細(xì)胞中的更大，而包涵體結(jié)構(gòu)又被認(rèn)為是ＲＳＶ病逡逑毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄的中心，所以這可能表明ＳＧｓ有利于病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄。并且，當(dāng)沉逡逑默Ｇ３ＢＰ的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞形成ＳＧｓ的能力大大降低，此時(shí)再用ＲＳＶ感染細(xì)胞發(fā)逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373.13

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本文編號(hào)：2616426