【摘要】：目的(1)探究小鼠汗腺細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白在二維(two-dimensional,2D)培養(yǎng)環(huán)境下對小鼠乳腺祖細(xì)胞(Mammary Progenitor Cells,MPCs)體外分化過程中的作用。(2)探究生物三維(three-dimensional,3D)打印的汗腺微環(huán)境對MPCs在體外分化過程中的作用,為應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建體外適宜的細(xì)胞生長微環(huán)境提供可靠的理論基礎(chǔ)。(3)探究MPCs在體外構(gòu)建的汗腺微環(huán)境中的分化方向,為體外構(gòu)建能定向誘導(dǎo)細(xì)胞分化的理想微環(huán)境提供新的研究思路。(4)探究生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)MPCs分化的可能機(jī)制,為生物3D打印汗腺微環(huán)境在臨床中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法(1)取新生小鼠足部勻漿作為汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的來源。分別提取新生小鼠的MPCs和成年小鼠的汗腺細(xì)胞,通過查閱大量文獻(xiàn)并利用免疫熒光染色技術(shù)篩選出MPCs與汗腺細(xì)胞中所表達(dá)的差異蛋白即汗腺發(fā)育過程中的鈉/鉀通道蛋白(Adenosine Triphosphate 1a1,ATP1a1)。MPCs在2D環(huán)境條件下培養(yǎng)時向培養(yǎng)基中加入汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,收集細(xì)胞后采用免疫熒光和反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技術(shù)檢測其差異蛋白的表達(dá)情況從而探究汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在2D培養(yǎng)環(huán)境下對MPCs分化的作用。(2)明膠和海藻酸鈉經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)充分溶解后按比例配制成可打印的生物墨水并加入汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,包裹MPCs后利用生物3D打印技術(shù)將其打印成多層網(wǎng)格狀從而構(gòu)建體外汗腺微環(huán)境模型。對照組設(shè)置為與實(shí)驗(yàn)組相比無汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組和未打印組。光鏡下觀察各組細(xì)胞在微環(huán)境中的增殖發(fā)育情況。通過免疫熒光分析和RT-qPCR技術(shù)檢測MPCs中差異蛋白的表達(dá)情況并探究生物3D打印的汗腺微環(huán)境對MPCs分化的影響。(3)分離提取在生物3D打印的汗腺微環(huán)境中培養(yǎng)7和14天的MPCs,應(yīng)用免疫熒光染色和RT-qPCR技術(shù)分別在蛋白和分子水平上檢測經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞中汗腺腔上皮和肌上皮細(xì)胞特異蛋白CK8和CK14的表達(dá)情況,并進(jìn)一步通過免疫熒光雙染的方法觀察誘導(dǎo)細(xì)胞中兩種特異蛋白與差異蛋白ATP1a1共定位的結(jié)果,從而進(jìn)一步探究MPCs在生物3D打印的汗腺微環(huán)境中的分化方向。(4)前期實(shí)驗(yàn)成果及查閱文獻(xiàn)證明小鼠汗腺發(fā)育過程中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括EDA、NF-κb、Shh信號通路等。收集在汗腺微環(huán)境中誘導(dǎo)7和14天的細(xì)胞,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)分析以上通路在誘導(dǎo)后細(xì)胞中的表達(dá)情況。篩選出表達(dá)明顯上調(diào)的信號通路并在誘導(dǎo)過程中加入該信號通路的抑制劑,應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)來進(jìn)一步檢驗(yàn)此信號通路在誘導(dǎo)后細(xì)胞中的表達(dá)情況,從而探究生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)MPCs向汗腺分化的相關(guān)機(jī)制。根據(jù)文獻(xiàn)報道,測定微環(huán)境的硬度,推測微環(huán)境硬度對MPCs分化方向的影響。結(jié)果(1)2D培養(yǎng)環(huán)境條件下,無論培養(yǎng)環(huán)境中是否添加汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,MPCs中汗腺細(xì)胞特異蛋白ATP1a1的表達(dá)均為陰性。結(jié)果表明汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在2D培養(yǎng)環(huán)境下不能特異性誘導(dǎo)MPCs向汗腺細(xì)胞分化。(2)對照組中培養(yǎng)的細(xì)胞其免疫熒光和RT-qPCR結(jié)果均顯示其無明顯的特異蛋白ATP1a1表達(dá)。而培養(yǎng)在生物3D打印后的汗腺微環(huán)境中的MPCs表達(dá)差異蛋白ATP1a1,并在誘導(dǎo)第14天時表達(dá)有明顯的上調(diào)。免疫熒光染色結(jié)果顯示乳腺細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白雌激素受體α(Estrogen Receptor-α,ER-α)在ATP1a1表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中其表達(dá)水平較未誘導(dǎo)時有明顯的降低。分光光度計分析結(jié)果顯示使用的汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中無殘留的細(xì)胞成分,因此排除了汗腺相關(guān)細(xì)胞對這一誘導(dǎo)過程的干擾作用。這一結(jié)果證明了生物3D打印的汗腺微環(huán)境可以誘導(dǎo)MPCs向汗腺細(xì)胞特異分化,使生物3D打印在汗腺再生中具有重要意義。(3)免疫熒光和RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步顯示,MPCs經(jīng)生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)14天后,細(xì)胞中CK8的表達(dá)特異性上調(diào)。免疫熒光共定位結(jié)果示誘導(dǎo)后的細(xì)胞中ATP1a1與CK8共表達(dá)而與CK14無共表達(dá)現(xiàn)象。綜上可知,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)MPCs向汗腺腔上皮細(xì)胞方向特異性分化,為構(gòu)建理想的體外細(xì)胞和組織發(fā)育的微環(huán)境提供了新的思路。(4)RT-qPCR結(jié)果證明Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)MPCs向汗腺細(xì)胞分化的過程中的表達(dá)量明顯上調(diào)。微環(huán)境經(jīng)Shh信號通路的抑制劑處理后,RT-qPCR結(jié)果顯示,在培養(yǎng)第14天時細(xì)胞中ATP1a1與CK8的表達(dá)量明顯低于未經(jīng)抑制劑處理的細(xì)胞。此結(jié)果證明了Shh信號通路在生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)MPCs向汗腺細(xì)胞分化過程中具有重要作用,為進(jìn)一步研究體外汗腺再生奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。而微環(huán)境硬度的檢測結(jié)果顯示對照組硬度約是實(shí)驗(yàn)組的2倍,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)推測硬度較小的實(shí)驗(yàn)組微環(huán)境更有利于誘導(dǎo)MPCs向汗腺腔上皮細(xì)胞方向分化。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)對生物3D打印的汗腺微環(huán)境誘導(dǎo)MPCs向汗腺細(xì)胞分化的過程進(jìn)行了研究并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探索。發(fā)現(xiàn)汗腺細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合生物3D打印所構(gòu)建的汗腺發(fā)育特異的體外微環(huán)境與2D環(huán)境和未經(jīng)打印的三維環(huán)境相比可以有效誘導(dǎo)MPCs向汗腺腔上皮細(xì)胞分化并且有功能性蛋白的表達(dá)。其中Shh信號通路在這一誘導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用。微環(huán)境的硬度也可能影響了MPCs的分化方向。本實(shí)驗(yàn)為今后利用生物3D打印技術(shù)構(gòu)建理想的微環(huán)境和體外汗腺的再生提供了良好的理論基礎(chǔ)和新的思路。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、小鼠乳腺祖細(xì)胞與汗腺細(xì)胞的比較及其在 2D 誘導(dǎo)環(huán)境下的分化情況學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 小鼠乳腺祖細(xì)胞與汗腺細(xì)胞在形態(tài)功能上的異同以及差異蛋白的篩選小鼠汗腺細(xì)胞和小鼠 MPCs 經(jīng)分離提取，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，通過顯微鏡觀察到兩種細(xì)胞的形態(tài)相似，均成團(tuán)增殖，如鵝卵石樣排列（見圖 1.1）。

觀察到兩種細(xì)胞的形態(tài)相似，均成團(tuán)增殖，如鵝卵石樣排列（見圖 1.1）。圖 1.1 顯微鏡下觀察提取的小鼠汗腺細(xì)胞與 MPCs 的細(xì)胞形態(tài)。A：小鼠汗腺細(xì)胞形態(tài)；B：小鼠 MPCs 細(xì)胞形態(tài)。（標(biāo)尺：200μm）在對小鼠 MPCs 進(jìn)行 CK14 和 CK19 的免疫熒光共定位時，，我們發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞提取方法提取的小鼠 MPCs 中兩種蛋白的表達(dá)均為陽性（見圖 1.2），從而可以初步鑒定此細(xì)胞為小鼠 MPCs。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2;TP391.73

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本文編號：2615913