【摘要】：鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry,SOCE)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)鈣離子濃度降低或耗竭誘導的外鈣內(nèi)流方式,介導SOCE的離子通道叫鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels,SOCs)。鈣釋放激活鈣通道(calcium release-activated Ca~(2+)channel,CRAC)是最典型的一類SOCs,主要成分是基質(zhì)相互作用分子蛋白(stromal interaction molecule,STIM)和鈣釋放激活鈣通道蛋白(Orai)又稱鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)因子(calcium release-activated calcium channel molecule,CRACM)。Orai家族有3個同源蛋白:Orai1,Orai2和Orai3;STIM有2個亞型:STIM1和STIM2。經(jīng)典的SOCE由STIM1和Orai1介導。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的STIM1是單跨膜蛋白:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔N端作為感受器感受鈣庫鈣離子濃度變化;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜TM區(qū)將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔鈣離子濃度變化信號傳遞給胞漿游離的C末端;胞漿C末端發(fā)生構(gòu)象變化形成寡聚體,并轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜靠近細胞膜的位置形成斑塊狀(puncta)結(jié)構(gòu),結(jié)合并激活Orai1通道。Orai1是細胞膜上四跨膜的通道蛋白,是一種高選擇性Ca~(2+)通道,其N末端和C末端都在細胞內(nèi)。Orai1通常以二聚體形式存在,被STIM1激活后形成具有通道活性的六聚體,引發(fā)小幅度持續(xù)性鈣內(nèi)流,維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)。這個內(nèi)流的鈣電流叫CRAC電流(calcium release-activated Ca~(2+)current,I_(CRAC))。CRAC通道功能與機體免疫功能密切相關(guān),直接調(diào)控眾多免疫細胞如T細胞、B細胞、肥大細胞等的生理功能,參與免疫應答�；蛲蛔兛稍斐蒀RAC通道功能缺陷,導致肌張力減退、自身免疫病、無汗癥、外胚層發(fā)育不良和出血性疾病等,嚴重的甚至發(fā)生重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID),危及生命安全。雖然目前CRAC通道的分子構(gòu)成已被揭示,然而其通道調(diào)控分子機制仍需深入研究。2-氨基乙氧基苯硼酸(2-Aminoethoxy-diphenyl borate,2-APB)是一種膜通透性化合物,早期被證實為三磷酸肌醇受體(Inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP_3R)抑制劑。后來研究發(fā)現(xiàn)2-APB可作為一種非特異性通道阻滯劑,有效抑制SOCE,目前已經(jīng)成為研究CRAC通道的常用工具。2-APB對CRAC通道的影響非常復雜:低濃度(5μmol/L)的2-APB增強STIM1活化的I_(CRAC);高濃度(50μmol/L)的2-APB則表現(xiàn)短暫增強后快速抑制STIM1活化的I_(CRAC);高濃度(50μmol/L)的2-APB能直接門控Orai3和未結(jié)合STIM1的Orai1。2-APB激活CRAC通道的分子機制尚不明確。有人認為2-APB激活CRAC不需要STIM1,是直接作用于活化的Orai1,擴張Orai1通道孔直徑,促進鈣內(nèi)流。然而本研究發(fā)現(xiàn)2-APB可以通過改變STIM1的CT末端(a.a.235-685,C-terminal,CT)分子構(gòu)象暴露CAD結(jié)構(gòu)域激活Orai1,產(chǎn)生鈣內(nèi)流。1.2-APB誘導STIM1 CT末端與Orai1相互作用為研究2-APB增強CRAC電流的分子機制,本實驗在STIM1 CT末端(a.a.235-685,C-terminal,CT)連接雙熒光標簽蛋白(YFP-CT-CFP)后和Orai1-mKate共轉(zhuǎn)染入Hela細胞中,2-APB處理后,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)原均勻分布于細胞質(zhì)的YFP-CT-CFP轉(zhuǎn)位至細胞膜,與Orai1-mKate共定位。說明2-APB可誘導YFP-CT-CFP和Orai1-mKate形成復合物。再將YFP-CT-CFP和Orai1-YFP共轉(zhuǎn)染入Hela細胞,利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術(shù)監(jiān)測兩種蛋白分子之間的距離變化。在僅提供波長為405 nm的熒光標簽蛋白CFP的激發(fā)光條件下,分別在CFP和YFP發(fā)射波長處收集信號,給予細胞2-APB刺激,激光掃描共聚焦顯微鏡顯示,細胞質(zhì)內(nèi)原均勻分布的YFP-CT-CFP先后轉(zhuǎn)位至細胞膜與Orai1-YFP共定位,并且二者分子間FRET迅速增加。表明攜帶CFP的STIM1 CT末端與攜帶YFP的Orai1之間分子距離10 nm,即二者間存在直接的相互作用。上述結(jié)果提示2-APB誘導STIM1 CT末端與Orai1相互作用。2.2-APB誘導STIM1 CT末端與Orai1相互作用并激活Orai1通道利用紅色熒光的基因Ca~(2+)探針(genetically-encoded Ca~(2+)indicator,GECI)CMV-R-GECO1.2監(jiān)測細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度變化。在Hela細胞中過表達YFP-CT-CFP,Orai1-CFP和CMV-R-GECO1.2后,加入不同濃度的2-APB,通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),低濃度的2-APB(5μmol/L)誘導了持續(xù)激活的Ca~(2+)內(nèi)流,而高濃度2-APB(20μmol/L)則先激活強烈的Ca~(2+)內(nèi)流后后快速阻斷Ca~(2+)內(nèi)流。3.2-APB誘導STIM1 CT末端CAD結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)檠芯縎TIM1CT末端如何激活Orai1,首先將YFP-CT-CFP單轉(zhuǎn)入Hela細胞中,給與2-APB刺激,共聚焦顯微鏡記錄發(fā)現(xiàn)YFP-CT-CFP分子內(nèi)FRET降低,提示STIM1 CT末端的折疊狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樯熘毙蜆?gòu)象。隨后于STIM1 CT末端的CRAC活化結(jié)構(gòu)域(CRAC activation domain,CAD)上連接相同的雙熒光標簽蛋白(YFP-CAD-CFP),將構(gòu)建好的質(zhì)粒單轉(zhuǎn)Hela細胞后,重復上述步驟,共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)YFP-CAD-CFP分子內(nèi)FRET雖降低卻并未形成斑塊狀聚集,也未轉(zhuǎn)位至細胞膜。與Orai1-mKate共轉(zhuǎn)時,YFP-CAD-CFP與過表達的Orai1在2-APB刺激后也不能發(fā)生共定位。由此揭示2-APB也能誘導STIM1 CT末端的CAD結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變。4.2-APB誘導STIM1 CT末端與Orai1相互作用依賴于Orai1的CBD和NBD結(jié)構(gòu)域本實驗將構(gòu)建的缺失Orai1 C末端的STIM1結(jié)合位點(a.a.272-292,C-terminal CAD binding domain,CBD)和N末端的STIM1結(jié)合位點(a.a.73-85,N-terminal CAD binding domain,NBD)的表達載體Orai1-?CBD-mKate及Orai1-?NBD-mKate分別與YFP-CT-CFP共轉(zhuǎn)Hela細胞,加入2-APB后,共聚焦記錄熒光變化。結(jié)果顯示過表達Orai1-?CBD-mKate的Hela細胞中的YFP-CT-CFP不能與Orai1-?CBD-mKate共定位于細胞膜,而缺失NBD表現(xiàn)與YFP-CT-CFP的共定位顯著減少。據(jù)此表明2-APB誘導的Orai1和STIM1 CT末端之間的相互作用取決于Orai1的CBD片段,而NBD在此過程中起次要作用。結(jié)論:本研究證明2-APB通過促使STIM1 CT末端產(chǎn)生構(gòu)象變化,暴露Orai1激活位點,誘導STIM1 CT末端與Orai1直接相互作用進而活化Orai1,引發(fā)細胞鈣內(nèi)流。Orai1的CBD片段和NBD片段均與2-APB誘導的STIM1 CT末端與Orai1結(jié)合相關(guān)。
【圖文】：

15圖 1. STIM1 CT 末端和 Orai1 分布示意圖。A 示（左）50 μmol/L 2-APB 處理前后，共表達 Orai1-mKate 和 ST1-CT-YFP 的 HeLa 細胞內(nèi) Orai1-mKate 和 ST1-CT-YFP 分布變化圖；比例尺為 10 μm。（右）熒光共定位量化分析圖顯示該分布的變化。綠色表示 ST1-CT-YFP，

17圖 2. 2-APB 誘導 YFP-CT-CFP 和 Orai1-CFP 相互作用并產(chǎn)生巨大 Ca2+內(nèi)流。YFP-CT-CFP，Orai1-CFP 和 CMV-R-GECO1.2 共轉(zhuǎn)染 Hela 細胞。48 小時后，在共聚焦顯微鏡中觀察活細胞。A示50 μmol/L 2-APB處理前后共聚焦下熒光分布改變；比例尺為20 μm。B 示 CMV-R-GECO1.2 記錄下的不同濃度 2-APB 誘導的 Ca2+內(nèi)流。C 示分別在 0 秒，，446
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R341

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