【摘要】：目的:本研究旨在利用分子生物學方法鑒定大理州地區(qū)片形吸蟲的種類,分析其遺傳多樣性,驗證是否存在雜合型片形吸蟲及其雜合程度,在一定程度上豐富該地區(qū)片形吸蟲分類的科學依據(jù)。深入探討大理片形吸蟲的種內(nèi)差異、種間差異和親緣關系,尋找優(yōu)勢種,為今后大理地區(qū)制定片形吸蟲病的防治策略,改進防治措施提供理論基礎,以保護人群健康并降低經(jīng)濟損失。本研究選用了多個分子標記,方便與前人的研究進行對比,明確大理地區(qū)片形吸蟲遺傳多態(tài)性與其他地域間的差異,同時探討不同分子標記的應用潛力。方法:從大理州下關農(nóng)貿(mào)市場采集到9頭感染片形吸蟲的黃牛肝臟,從中分離獲得122條片形吸蟲成蟲,并孵育獲得其蟲卵。分別提取122條片形吸蟲成蟲及其蟲卵的基因組DNA,PCR擴增核糖體ITS+序列,線粒體COX I和NAD I序列進行擴增并測序,所得序列經(jīng)BLAST在線工具進行比對,進行同源性分析;并結合pepck基因的多重PCR結果判定蟲種。應用BioEdit軟件對測序結果進行多重比對,進一步分析122條片形吸蟲親代及子一代的遺傳變異。ITS+測序圖譜中特定雜合位點等位基因的峰高比值即雜合體攜帶肝片形吸蟲和巨片形吸蟲基因的比例,據(jù)此推測不同個體的雜合程度。另收集廣西南寧的巨片形吸蟲作為對照蟲種與之進行比較。結果:ITS+全長945/946bp,出現(xiàn)11個變異位點,122條采自大理的片形吸蟲,7條為肝片形吸蟲(5.74%),115條為雜合型片形吸蟲(94.26%),其中雜合型片形吸蟲在序列圖譜中11個變異位點出現(xiàn)雙峰,個體間雙峰比值存在明顯差異,提示其攜帶巨片形吸蟲與肝片形吸蟲基因的比例不同,從Fg:Fh≥10:1到Fg:Fh≤1:10不等。NAD I全長535bp,共出現(xiàn)48處變異位點,1條(0.82%)NAD I序列與肝片形吸蟲相同,121條(99.18%)與巨片形吸蟲高度同源,121條中有116條堿基序列完全一致,其余5條各存在單個堿基的突變。COXI全長438bp,共有42處變異位點,122條片形吸蟲中,1條(0.82%)COXI序列與肝片形吸蟲相同,121條(99.18%)與巨片形吸蟲相同,121條中有120條堿基序列完全一致,余1條有1個變異位點。pepck的多重PCR結果顯示所有大理地區(qū)的片形吸蟲樣本均可擴增出肝片形吸蟲和巨片形吸蟲的雙重條帶,為雜合型片形吸蟲。綜合ITS+、NADI、COXI序列的測序和pepck的多重PCR結果,122條檢測的片形吸蟲均為Fg/Fh雜合型片形吸蟲。蟲卵(子一代)線粒體COXI、NADI序列與母本完全一致;ITS1序列,蟲卵與母體的分型完全一致,但其雜合程度存在分化現(xiàn)象。結論:本次試驗結果初步認為大理地區(qū)的片形吸蟲已經(jīng)高度雜合。NAD I和COX I分子標記結果相似,122條大理片形吸蟲樣本中僅DL1-10為肝片形吸蟲,其余均為巨片形吸蟲。由于線粒體按照母系方式遺傳,據(jù)此可知巨片形吸蟲是大理片形吸蟲主要的母系來源。ITS序列將大理樣本分為肝片形吸蟲(7)和雜合型片形吸蟲(115)兩類,但該序列區(qū)段顯示為肝片形吸蟲的樣本(7/122)均被pepck識別為雜合體,因此為了使片形吸蟲的分類鑒定結果更為準確可靠,應選取多個標識序列進行分析。本研究中根據(jù)不同分子標記中個別堿基的差異,可進一步劃分為8個基因亞型,其中,Fsp1基因亞型占89.34%,為大理地區(qū)片形吸蟲的優(yōu)勢亞型。
【圖文】：

逑和ＮＡＤ邋Ｉ的序列特征，對我國１３個省市的２１１條片形吸蟲樣本進行分類研宄。逡逑結果見圖２，烏魯木齊、西寧、呼和浩特市的樣本均為肝片形吸蟲，而廣州地區(qū)逡逑的樣本均為巨片形吸蟲，在長沙、貴陽和昆明也發(fā)現(xiàn)了巨片形吸蟲。值得注意的逡逑是，１２３條中國無精型片形吸蟲中有１２２條屬于雜合型個體，僅１條無精型樣本逡逑被鑒定為純種巨片形吸蟲。另一方面，，１１條來自長春、武漢、長沙、昆明的生逡逑精能力正常的片形吸蟲也屬于雜合型片形吸蟲。該結果表明肝片形吸蟲和巨片形逡逑吸蟲分別分布于中國大陸的北部和南部，雜合型片形吸蟲分布廣泛，在我國占據(jù)逡逑主導地位（６３．０％）。逡逑＿邐；邐－ｉ：邋＇邋Ａ邋Ａ邐、逡逑？ｉｆ邐Ｘｍｉｎｇ邐？逡逑Ｉ、r>｜邋

本文編號：2614308