【摘要】：目的:本實驗通過RNAa和RNAi技術(shù)在裸鼠肝癌HepG 2腫瘤模型上,通過上調(diào)p21基因表達,下調(diào)MTH 1基因表達,在動物整體水平研究對肝癌HepG 2腫瘤的抑制作用,為肝癌治療提供新的治療策略。方法:首先在體外培養(yǎng)肝癌HepG 2細胞,當HepG 2細胞生長到對數(shù)生長期時,將HepG2腫瘤細胞注射在裸鼠右前肢腋下以建立種植瘤裸鼠動物模型。將荷瘤成功的裸鼠隨機分為4組:對照組(CT)、saRNA-p21轉(zhuǎn)染組(P21)、siRNA-MTH 1轉(zhuǎn)染組(MTH1)和雙轉(zhuǎn)染聯(lián)合組(P21+MTH 1),每組6只。腫瘤動物模型建立成功后在瘤旁注射給藥,三天一次,每鼠每次19.8μg,持續(xù)給藥30天。給藥期間觀察各組裸鼠的生活狀況、腫瘤體積變化以及生存時間。給藥結(jié)束后,取下腫瘤組織進行脫水包埋,制備成冰凍切片。通過HE染色法觀察各組腫瘤組織中腫瘤細胞的病理形態(tài),實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組p21和MTH 1基因mRNA的相對表達情況;免疫熒光方法檢測各組腫瘤組織中P21、MTH 1蛋白的表達;Western blot和ELISA方法檢測各組腫瘤組織中P21、MTH 1以及凋亡相關(guān)蛋白Bak、Caspase-3的相對表達水平;同時建立裸鼠肝癌HepG 2腫瘤模型進行RNAs與順鉑藥的藥效對比研究,將荷瘤成功的裸鼠隨機分為3組:對照組(CT)、雙轉(zhuǎn)染組(P21+MTH 1)、順鉑組,每組6只。腫瘤動物模型建立成功后在瘤旁注射給藥,三天一次,RNAs和順鉑藥每鼠每次40μg,持續(xù)給藥30天。給藥期間觀察各組裸鼠的生活狀況、腫瘤體積變化以及生存時間。結(jié)果:肝癌HepG 2腫瘤裸鼠動物模型成功建立,成瘤率均為100%,裸鼠的生存率為100%;腫瘤體積增長曲線結(jié)果顯示,P21組、MTH 1組腫瘤體積增長速度低于CT組,P21+MTH 1組差異更為顯著;qPCR和WB結(jié)果顯示,體內(nèi)轉(zhuǎn)染靶向p21基因的saRNA和靶向MTH 1基因的siRNA后,轉(zhuǎn)染組相比對照組,p21的mRNA水平和蛋白水平顯著升高,MTH 1的mRNA水平和蛋白水平顯著降低,聯(lián)合轉(zhuǎn)染組差異更為顯著。ELISA結(jié)果顯示,聯(lián)合雙轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中Bak蛋白表達量增加,而單轉(zhuǎn)染組則無明顯變化。另外,Caspase-3蛋白在轉(zhuǎn)染RNAs的實驗組中表達均有所升高,且雙轉(zhuǎn)染組表達量明顯高于單轉(zhuǎn)染組。藥效實驗的腫瘤體積增長曲線結(jié)果顯示,相對于對照組,順鉑組與雙轉(zhuǎn)染組對腫瘤體積增長有類似的抑制作用,且雙轉(zhuǎn)染組小鼠存活率遠遠高于順鉑組。結(jié)論:上調(diào)p21基因和下調(diào)MTH 1基因表達可有效抑制HepG 2腫瘤的生長。p21和MTH 1基因表達的共同調(diào)節(jié)作用比僅調(diào)節(jié)MTH 1或p21基因表達時抑制效果更為顯著。此外,siRNA靶向p21基因與saRNA靶向MTH 1基因的聯(lián)合調(diào)控可誘導(dǎo)HepG 2細胞凋亡,其機制有可能與Bak/Bcl-xl凋亡途徑中Bak的表達升高有關(guān)。且聯(lián)合調(diào)控癌基因表達效果優(yōu)于單一調(diào)控。藥效對比實驗結(jié)果表明,在治療過程中RNAs藥物與順鉑藥物相比治療效果類似,但對機體所產(chǎn)生的的毒副作用遠遠小得多。
【圖文】：

3.1 荷瘤小鼠一般生理情況觀察裸鼠在接種 HepG 2 細胞后生存狀況良好，飲食正常，6 天后所有小鼠塊，測量腫瘤體積后均達到成瘤標準（>100 mm3），成瘤率 100%，組間無顯隨著實驗的進行，，單轉(zhuǎn)染 saRNA-p21/siRNA-MTH 1 組小鼠腫瘤的生長速度轉(zhuǎn)染 saRNA-p21+siRNA-MTH 1 組小鼠腫瘤的生長速度與對照組相比更為緩后期，對照組小鼠逐漸出現(xiàn)食欲不振、精神下降、活動異常等現(xiàn)象。3.2 siRNA 和 saRNA 給藥對小鼠腫瘤體積、質(zhì)量和生存率的影響給藥 30 天后對比各組裸鼠腫瘤的體積大小、重量以及生長速度。轉(zhuǎn)染大小明顯小于對照組，雙轉(zhuǎn)染組差異更為顯著（圖 1 A）。轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤比對照組明顯降低，雙轉(zhuǎn)染組差異更為顯著（圖 1 B）。轉(zhuǎn)染組腫瘤重量明組，雙轉(zhuǎn)染組差異更為顯著（圖 1 C）。對照組的腫瘤體積及腫瘤重量與轉(zhuǎn)存在明顯的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中 saRNA-p21+siRNA-MTH的效果尤為明顯。結(jié)果如下圖所示：

青島大學(xué)*士學(xué)位論文Fig. 1 A contrast image of tumor size, B contrast image of tumor growth rate and C ctumor weight after dissection.The results showed that RNAs could significantly inhibit tHepG 2 tumors in nude mice.3.3 HE 染色法觀察腫瘤組織的細胞形態(tài)分析 HE 染色結(jié)果得出，轉(zhuǎn)染組與對照組相比，腫瘤組織內(nèi)腫瘤細嚴重，雙轉(zhuǎn)染組與對照組相比更為嚴重。如圖 2 所示：圖 2
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;R-332

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本文編號：2613470