【摘要】：背景:癌細(xì)胞的無限增殖需要基因組的快速復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,因此靶向生物大分子核酸的化療藥物的治療方法是對(duì)抗癌癥的重要手段。除了靶向雙鏈DNA外,近年來,靶向基因組G-四鏈體核酸的小分子配體受到廣泛的關(guān)注。在基因組中,形成G-四鏈體的核酸序列在癌基因啟動(dòng)子區(qū)域和端粒區(qū)域富集。靶向G-四鏈體的小分子化合物通過下調(diào)癌基因的轉(zhuǎn)錄和抑制端粒酶的表達(dá)從而發(fā)揮抗腫瘤作用。大多數(shù)G-四鏈體配體具有多芳香平面環(huán)結(jié)構(gòu),G-四鏈體結(jié)構(gòu)與配體通過π-π堆積等相互作用而被穩(wěn)定從而阻礙基因復(fù)制并導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂。由于G-四鏈體配體的平面環(huán)結(jié)構(gòu)與帶正電荷基團(tuán)的因素,部分配體與雙鏈DNA具有一定的親和力。針對(duì)G-四鏈體配體是通過穩(wěn)定G-四鏈體或是嵌入雙鏈DNA中發(fā)揮抗癌作用仍存在爭(zhēng)議。目的:此前有文獻(xiàn)報(bào)道配體與雙鏈DNA有作用,但傳統(tǒng)生化方法檢測(cè)藥物和DNA結(jié)合的靈敏度有限。另外配體與雙鏈DNA結(jié)合的模式和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)尚不清楚,影響了對(duì)配體與雙鏈DNA作用的系統(tǒng)性理解。因此對(duì)G-四鏈體配體與雙鏈DNA的作用的研究有助于闡明配體對(duì)于雙鏈DNA的影響及尋找和設(shè)計(jì)選擇性好的G-四鏈體配體提供數(shù)據(jù)支持。方法:首先,我們以lamdba-DNA為模板通過PCR的方法擴(kuò)增出5’末端分別修飾生物素和巰基的6618 bp雙鏈DNA,將PCR產(chǎn)物純化回收,并通過化學(xué)修飾將雙鏈DNA連與玻璃表面與超順磁球之間,進(jìn)行雙鏈DNA單分子拉伸實(shí)驗(yàn)研究。其次,我們利用磁鐵產(chǎn)生的梯度磁力進(jìn)行單分子雙鏈DNA拉伸操作。通過記錄受不同恒力下的磁球高度確定雙鏈DNA的拉伸長度變化,以進(jìn)行對(duì)雙鏈DNA在受力后力譜的研究。在不同恒力下,加入配體后記錄DNA的伸長高度,依據(jù)DNA的伸長以判別該配體與雙鏈DNA可能的結(jié)合方式,通過希爾函數(shù)擬合得到配體與雙鏈DNA作用的解離常數(shù)(K_d),并計(jì)算單分子配體嵌入DNA后導(dǎo)致DNA的伸長量((35)x),以及計(jì)算結(jié)合雙鏈DNA的相鄰兩配體分子間隔的堿基數(shù)(n)等信息。結(jié)果:將吖啶類G-四鏈體配體BRACO-19、RHPS4、雜環(huán)類CX-5461以及卟啉類TMPyP4與雙鏈DNA結(jié)合的力-拉伸和濃度-伸長曲線與EB的相比,我們發(fā)現(xiàn)CX-5461結(jié)合雙鏈DNA后DNA的伸長量大于EB,其他配體與EB相似。另外我們定量分析出了以上四個(gè)配體與雙鏈DNA的解離常數(shù)(K_d),范圍在0.59?M-2 uM之間。配體BRACO-19、RHPS4、CX-5461和TMPyP4與雙鏈DNA有較強(qiáng)的嵌入結(jié)合,這一結(jié)果與此前報(bào)道一致,其中相鄰兩配體分子結(jié)合雙鏈DNA之間的距離為1.9-3.1個(gè)堿基之間。另外,卟啉類配體NMM、喹啉類配體PDS、Phen-DC3及喹嗪類配體TrisQ與雙鏈DNA結(jié)合導(dǎo)致的DNA的伸長量低于EB,其中NMM在低濃度(1,4,8,80?M)幾乎不與雙鏈DNA結(jié)合。并且Phen-DC3和TrisQ分子在一定的拉力下需間隔3個(gè)以上的堿基才能與雙鏈DNA結(jié)合。我們分析得到了八個(gè)G-四鏈體配體在雙鏈DNA上的結(jié)合數(shù)量,其中NMM、PDS、Phen-DC3和TrisQ在雙鏈DNA的結(jié)合數(shù)目較少,其他配體與EB接近。這一結(jié)果表明Phen-DC3和TrisQ是選擇性較好的G-四鏈體配體。結(jié)論:綜上我們發(fā)現(xiàn)配體CX-5461、BRACO-19、RHPS4和TMPyP4與雙鏈DNA發(fā)生較強(qiáng)的嵌入結(jié)合;NMM、PDS、Phen-DC3和TrisQ與雙鏈DNA結(jié)合相對(duì)弱些,是選擇性較好的G-四鏈體小分子化合物。
【圖文】：

細(xì)胞白血病及成年人和兒童的急性淋巴細(xì)胞白血病[11]。阿霉素治療包括急性淋巴細(xì)胞白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢1]。米托蒽醌與其他抗癌藥物聯(lián)用可治療成年人的急性非淋巴細(xì)吖啶可治療成年人的急性白血病和惡性淋巴瘤，但是在實(shí)體瘤 DNA 的藥物是臨床上治療腫瘤的有效制劑，并且與其他不同合使用時(shí)明顯提高患者的存活率，但是由于其的毒副作用和藥其臨床使用，上述 4 種抗腫瘤蒽環(huán)化合物會(huì)導(dǎo)致心臟毒性，最致死亡[2]。該類靶向 DNA 的藥物在發(fā)揮藥效時(shí)不僅與腫瘤細(xì)與非病變細(xì)胞的 DNA 反應(yīng)，從而產(chǎn)生藥物的毒副作用。因此 DNA 并且毒性小的藥物是人們不懈研究的目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)生殊構(gòu)型的 DNA-G-四鏈體，該構(gòu)型的 DNA 與癌癥和艾滋病等關(guān)系。

2 G-四鏈體核酸結(jié)構(gòu)雙鏈 DNA（B-DNA）是經(jīng)過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成右手螺旋的 DNA 二級(jí)，，具有彈性和柔韌性的 B-DNA 儲(chǔ)存并傳遞遺傳信息。然而，在 20 世紀(jì) 5后期，人們發(fā)現(xiàn)了不同于 B-DNA 二級(jí)構(gòu)型的 DNA，到目前為止，已發(fā)現(xiàn) 種不同的 DNA 構(gòu)象，如左手螺旋 Z-DNA，發(fā)卡構(gòu)型 DNA, 滑動(dòng)結(jié)構(gòu) Dotif，三重結(jié)構(gòu) DNA 和 G-四鏈體[15]。 每種構(gòu)型 DNA 都有各自獨(dú)特的生義。其中 G-四鏈體核酸是最近幾十年人們研究的一個(gè)焦點(diǎn)。G-四鏈體是鳥嘌呤（G）的真核生物 DNA 或 RNA 單鏈通過 8 個(gè) hoogsteen 氫鍵組成 體，然后有至少兩個(gè) G-四分體堆疊而成為特殊的 G-四鏈體核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)證實(shí) G-四鏈體 DNA 能被單價(jià)正離子如 K+,Na+穩(wěn)定[16]。依據(jù)形成 G-四A 鏈的數(shù)量，G-四鏈體 DNA 可折疊為分子間四分子 G-四鏈體，分子間 G-四鏈體，分子內(nèi) G-四鏈體[17]。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R394

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本文編號(hào)：2612281