【摘要】：目的 建立一種可以用于共生菌群研究的恒河猴動物模型,并對腸道共生菌群改變后機體免疫系統(tǒng)中T淋巴細胞亞群的變化與柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,CA16)感染進程和病理學(xué)變化之間的關(guān)系進行研究。方法 本研究聯(lián)合使用氨基糖苷類、青霉素類、糖肽類和硝基咪唑類等4類廣譜抗生素,通過飼喂聯(lián)合抗生素的方法來構(gòu)建共生菌群被清除的靈長類動物模型;應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)和擴增子測序技術(shù)相結(jié)合的方法檢測腸道和呼吸道共生菌群多樣性和豐富度,同時應(yīng)用宏病毒組測序和代謝組學(xué)方法來分析機體微生物代謝產(chǎn)物和共生病毒組成的改變;在CA16感染后,觀察恒河猴出現(xiàn)的發(fā)熱、手足口皰疹等臨床癥狀;RT-qPCR檢測病毒血癥和各組織器官中的病毒載量;HE染色觀察抗生素處理后和感染后各組織器官的病理變化;并通過流式細胞術(shù)、液相芯片技術(shù)、表達譜芯片和免疫熒光等方法對恒河猴機體免疫系統(tǒng)變化和CA16感染進行檢測和觀察。結(jié)果 本研究按實驗設(shè)計分為兩個部分。在第一部分建立動物模型的研究中,根據(jù)實時熒光定量PCR結(jié)果,在飼喂抗生素后第9天總16S rRNA基因相對豐度下降80%以上,隨后菌群豐度保持著相對較低的水平。根據(jù)腸道菌群擴增子測序結(jié)果,抗生素處理后第9天恒河猴腸道共生菌OTU水平下降90%以上,14天后檢測到腸道優(yōu)勢菌轉(zhuǎn)變?yōu)榘ＯＪ暇?志賀菌,該物種組成能夠長期保持穩(wěn)定。重塑后的腸道菌群豐度較低,且沒有觀察到對機體健康有有害的影響。根據(jù)呼吸道共生菌群測序結(jié)果,抗生素處理后恒河猴呼吸道共生菌群在屬分類水平上的優(yōu)勢菌群組成和結(jié)構(gòu)有所改變,但仍具有豐富的呼吸道菌群和菌群多樣性。此外,腸道病毒組和代謝組的檢測結(jié)果表明,隨著腸道共生菌群的清除病毒組中噬菌體和DNA病毒豐富度顯著下降,因此病毒組豐度與共生菌群多樣性之間存在著正相關(guān)的關(guān)系;原有的腸道菌群代謝產(chǎn)物在抗生素處理之后色氨酸等代謝產(chǎn)物顯著減少,而鳥氨酸、甘露醇、蘇糖醇、糖胺聚糖等代謝產(chǎn)物水平顯著增高。外周免疫細胞的檢測結(jié)果表明抗生素處理后恒河猴外周血中T淋巴細胞比例顯著升高,B淋巴細胞比例下降;對抗生素處理恒河猴的PBMCs進行表達譜分析結(jié)果則表明,IL13、VCAM1和IL1基因表達水平上調(diào)了5倍以上,其他固有免疫相關(guān)基因的表達水平也有著顯著變化。在第二部分腸道共生菌與CA16感染之間的相互作用關(guān)系研究中,腸道共生菌群缺失的恒河猴與正常恒河猴一樣均可以被CA16感染,并在感染后3～4天出現(xiàn)體溫升高、手口部位皰疹等臨床癥狀;腸道共生菌群缺失的恒河猴在感染后第3天檢測出病毒血癥,而正常恒河猴在感染后第5天檢測出病毒血癥,且腸道共生菌群缺失的恒河猴病毒血癥持續(xù)時間更長、病毒載量峰值更高;腸道共生菌群缺失恒河猴各主要組織中病毒載量峰值出現(xiàn)的時間更晚、峰值更高且清除時間更久,病理變化也更嚴(yán)重。在CA16感染后,腸道共生菌群缺失恒河猴沒有產(chǎn)生有效的中和抗體水平,且分泌IgG的B細胞水平也低于正常恒河猴。免疫熒光結(jié)果也驗證了腸道共生菌群缺失恒河猴CD3+T淋巴細胞和感染后的病毒顆粒在小腸組織中的數(shù)量更多。CA16感染后外周免疫細胞和細胞因子的檢測結(jié)果表明,在腸道共生菌群缺失恒河猴中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞比例高于正常水平,CD8+和CD20+淋巴細胞應(yīng)答水平在CA16感染早期則低于正常恒河猴,CD3+CD4+IFNγ+淋巴細胞比例也明顯下降;Th17/Treg細胞比例和IL17A細胞因子水平也有所改變;CD3+CD4+GATA3+淋巴細胞比例及其分泌的多種細胞因子水平在感染中后期大幅度升高。CA16感染后抗生素處理組恒河猴的組織局部免疫與正常恒河猴相比,小腸中CD3+CD4+IL17A+、CD3+CD4+GATA3+淋巴細胞比例增加,而CD3+CD4+IFNγ+淋巴細胞比例減少,CD4+CD25+淋巴細胞比例兩組的差異不大。結(jié)論 本研究的結(jié)果表明在不影響機體健康狀態(tài)的前提下,短期飼喂高劑量聯(lián)合抗生素后即能有效清除恒河猴腸道共生菌,達到建立可用于腸道共生菌群研究的恒河猴動物模型的目的;同時,恒河猴腸道共生菌群的缺失會影響菌群代謝產(chǎn)物水平、機體腸道病毒組組成和外周血中淋巴細胞水平。應(yīng)用CA16病毒感染動物模型,腸道共生菌群缺失的恒河猴與正常恒河猴一樣均可以被感染并出現(xiàn)臨床癥狀;但與正常恒河猴相比,腸道共生菌群缺失恒河猴在感染后的病毒血癥和組織中病毒載量情況更嚴(yán)重且清除時間更久。與機體免疫系統(tǒng)變化進行比較分析,我們發(fā)現(xiàn)腸道共生菌群缺失恒河猴的全身和局部免疫系統(tǒng)中Th17/Treg細胞比例失衡、Th2細胞比例增多及其分泌的多種細胞因子水平上調(diào),這些T細胞亞群比例的失衡和偏向性可能會加重機體炎性反應(yīng)、影響CD8+T淋巴細胞應(yīng)答和B細胞分化及抗體的產(chǎn)生,進而導(dǎo)致CA16持續(xù)性感染并加重病理損傷�？偟膩碚f,本研究證實了恒河猴腸道共生菌群的改變可能會通過調(diào)節(jié)機體Th2/Th1、Th17/Treg細胞比例的平衡來影響CA16感染的進程和病理變化。
【圖文】：

第３天每ｍｇ糞便中菌群拷貝數(shù)下降了邋１０３？１０４倍；第７？８天菌群數(shù)量有所回升，逡逑在抗生素配方中加入萬古霉素后菌群數(shù)量開始下降；２１天后菌群數(shù)量處于穩(wěn)定狀態(tài)，逡逑４只恒河猴每ｍｇ糞便中總腸道菌群拷貝數(shù)在４．５２Ｘ邋１0１３？１．１３５邋Ｘ邋１0１４。見

中未被測到的序列概率較低；在抗生素處理后，糞便樣品中菌群香農(nóng)指數(shù)顯著下降，逡逑２１天后ＯＴＵ數(shù)目減少９５．６％？９８．７％，且Ａｌｐｈａ多樣性指數(shù)的組間差異均具有統(tǒng)計逡逑學(xué)意義。見表６、
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2612163