【摘要】：治療移植排斥的理想方法是誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受,因?yàn)楹笳卟粫?huì)損害宿主的整體免疫功能,極大降低移植排斥治療中感染等疾病的發(fā)生率。納米技術(shù)的發(fā)展,極大促進(jìn)了抗原特異性免疫耐受誘導(dǎo)技術(shù)的提高。已有研究者開發(fā)出可以靶向殺傷同種抗原特異性T、B淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的納米顆粒,并在誘導(dǎo)移植耐受中得到有效證實(shí)。納米仿生顆粒在世界范圍內(nèi)被認(rèn)為是自身免疫性疾病和同種異體移植排斥反應(yīng)的有效免疫調(diào)節(jié)劑,但目前大多數(shù)納米仿生顆粒的設(shè)計(jì)思路主要集中在包裹緩釋可溶性抗原、毒素或細(xì)胞因子,并讓細(xì)胞通過吞噬或胞飲作用吞噬納米粒子進(jìn)而誘導(dǎo)致耐受性抗原提呈細(xì)胞如調(diào)節(jié)性DC,再通過后者誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞凋亡或抑制,很少有研究關(guān)注仿生納米顆粒與抗原特異性T細(xì)胞的直接接觸。而且以往研究中,仿生納米顆粒所負(fù)載的調(diào)節(jié)分子種類較少,多種免疫調(diào)節(jié)分子的聯(lián)合遞送很少見。研究目的:本研究制備聚乳酸-羥基乙酸納米粒(PLGA-NPs)并在其表面共價(jià)偶聯(lián)同種靶向抗原H-2K~b-Ig二聚體、負(fù)調(diào)節(jié)分子抗-Fas單抗、PD-L1-Fc和TGF-β以及抗吞噬分子CD47-Fc,研制可生物降解的、能直接靶向結(jié)合同種反應(yīng)性T細(xì)胞的、多效能的殺傷性PLGA納米粒,進(jìn)而探索其在小鼠同種異體皮膚移植模型中治療皮膚移植排斥的療效,作用機(jī)制以及可能引發(fā)的毒副作用等。研究方法及結(jié)果:1、PLGA納米粒的制備及表征:采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備了兩種規(guī)格的PLGA納米粒。掃描電子顯微鏡(SEM)觀察納米粒的形狀和大小,激光粒度檢測儀分析納米粒的直徑分布,Zeta電位儀檢測其表面的zeta電位。結(jié)果顯示,所制備的兩種規(guī)格的PLGA納米粒均呈規(guī)則圓形,表面光滑,其粒徑分別為202.4nm和78.8 nm(分別稱為200nm和80 nm粒子),平均Zeta電位分別為-3.09mv和-8.63mv。而后,通過改良的EDC/NHS化學(xué)法將聚乙烯亞胺(PEI)結(jié)合于納米顆粒表面,使其表面功能化,布滿-NH_2~+基團(tuán),從而能夠共價(jià)偶聯(lián)蛋白分子。2、殺傷性PLGA納米粒的制備及表型分析:在PEI修飾的PLGA納米粒表面偶聯(lián)BSA,用Micro BCA微量蛋白定量試劑盒分析PLGA納米粒表面的最大蛋白負(fù)載量。結(jié)果顯示,1 mg的直徑200 nm和80 nm粒子表面的最μμ大蛋白吸附量分別為75.31μg和77.51μg。以此為基礎(chǔ),在表面功能化的PLGA納米粒表面聯(lián)合吸附H-2K~b-Ig二聚體、抗-Fas單抗、PD-L1-Fc、TGF-β和CD47-Fc等5種免疫分子,制備多效能靶向殺傷性PLGA納米粒。通過相應(yīng)的熒光單抗染色和激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,H-2K~b-Ig二聚體、抗-Fas單抗、PD-L1-Fc和CD47-Fc四種分子均成功吸附于PLGA納米粒表面。因?yàn)闆]有相應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗TGF-β單抗,所以TGF-β的表面負(fù)載沒有檢測。3、小鼠同種皮膚移植模型的建立和殺傷性PLGA納米粒的體內(nèi)治療:7-8周齡的雄性C57BL/6小鼠(H-2K~b)作為皮膚供者,H-2K~b基因突變的C57BL/6小鼠(bm1鼠,H-2K~(bm1))作為皮膚受者,建立同種異體皮膚移植模型。在皮膚移植后第9、11和13天,將直徑200 nm的殺傷性PLGA納米粒經(jīng)尾靜脈輸注治療三次,同時(shí)設(shè)立7種對(duì)照PLGA納米粒治療組。每天觀察皮膚移植物存活狀態(tài),第15天時(shí)通過免疫熒光法檢測受者皮膚移植物中同種反應(yīng)T細(xì)胞、CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的浸潤程度。結(jié)果顯示,殺傷性PLGA納米粒能強(qiáng)有力地抑制移植排斥,延長皮膚移植物存活期達(dá)45天(MST 61天),其他對(duì)照組(PBS、Blank NPs、NP~(aFas)、NP~(Kb)、NP~(CD47)、NP~Kb/aFasb/aFas and NP~(Kb/aFas/PD-L1/TGFβ)等)的MST則分別為16、19、22、27、27、36和41天。第15天,H-2K~b-Ig二聚體的原位熒光染色顯示,皮膚移植中浸潤的H-2K~b同種抗原反應(yīng)性T細(xì)胞減少79.8%;單抗熒光染色顯示,皮膚移植物中浸潤的CD8~+T細(xì)胞和CD4~+T細(xì)胞分別減少了48.9%和36.4%;HE染色顯示炎性細(xì)胞的浸潤也明顯減少。另外,直徑80 nm的殺傷性PLGA納米粒的治療僅使皮膚移植物的存活期延長了22天,效果明顯弱于200 nm的殺傷性PLGA納米粒,因此后續(xù)研究中只關(guān)注200 nm的殺傷性PLGA納米粒。4、殺傷性PLGA納米粒的體內(nèi)作用機(jī)制:第三次治療后的2天(第15天),H-2K~(b-)Ig二聚體染色和流式分析顯示,殺傷性PLGA納米粒(Killer NPs)治療組移植鼠脾臟淋巴細(xì)胞群中,H-2K~b特異性同種反應(yīng)CD8~+T細(xì)胞的頻率下降了90.3%,對(duì)照組CD47~-killer NPs(NP~(Kb/aFas/PD-L1/TGFβ))and Anti-Fas~-killer NPs(NP~(Kb/PD-L1/TGFβ/CD47))分別下降了62.6%和51.9%,而無關(guān)同種抗原靶向的對(duì)照組(H-2K~d killer NPs)只下降了12.6%。在外周血中,80.7%的H-2K~b特異性同種反應(yīng)CD8~+T細(xì)胞被Killer NPs治療所清除;同時(shí),Killer NPs治療導(dǎo)致移植鼠脾臟中CD8~+T細(xì)胞的凋亡率增高3倍,CD47~-killer NPs和Anti-Fas~-killer NPs對(duì)照組分別增高113.5%和48.2%,而H-2K~d killer NPs對(duì)照組只有輕微增高。外周血中的情況與此相似;Killer NPs治療還使移植鼠脾臟活化狀態(tài)的CD8~+T細(xì)胞頻率下降了67.8%,使受者T細(xì)胞在體外與供者脾細(xì)胞混合培養(yǎng)中的同種增殖能力降低了50%;另外,Killer NPs治療還導(dǎo)致移植鼠脾臟和淋巴結(jié)中CD4~+/CD25~+/Foxp3~+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞頻率分別升高了81.7%和80.1%。5、殺傷性PLGA納米粒的體內(nèi)示蹤、組織分布和與免疫細(xì)胞的接觸:ICG標(biāo)記的殺傷性PLGA納米粒經(jīng)尾靜脈輸注皮膚移植鼠,利用小動(dòng)物活體遠(yuǎn)紅外成像儀在不同時(shí)間點(diǎn)觀察納米粒的體內(nèi)運(yùn)行規(guī)律,另在2 h時(shí)取移植鼠各器官進(jìn)行離體器官成像。結(jié)果顯示,Killer NPs可通過血液系統(tǒng)分布于脾臟、淋巴結(jié)、肝、腎、肺、心臟和皮膚移植物局部,熒光強(qiáng)度在30 min至4 h間最強(qiáng),體內(nèi)滯留時(shí)間可達(dá)30 h以上。同時(shí),H-2K~(b-)killer NPs(non-targeting killer NPs),CD47~-killer NPs和Blank NPs等對(duì)照納米粒的體內(nèi)運(yùn)行和組織分布與Killer NPs呈現(xiàn)部分差異,且體內(nèi)滯留時(shí)長明顯縮短,分別為24 h,24 h和18 h。利用PE標(biāo)記的Killer NPs經(jīng)尾靜脈輸注皮膚移植鼠,流式分析也顯示Killer NPs在外周血、脾臟和淋巴結(jié)中存在一定的頻率;熒光單抗染色和激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,移植鼠脾臟組織切片中,大量Killer NPs累積于紅髓和邊緣區(qū),與CD8~+T細(xì)胞有較多的熒光共定位,而與CD4~+T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC細(xì)胞接觸較少。相比較而言,CD47~-killer NPs在紅髓和邊緣區(qū)分布較少,而與上述除B細(xì)胞外的諸多免疫細(xì)胞呈明顯增多的熒光共定位。這些結(jié)果提示:在H-2K~b-Ig靶向抗原的引導(dǎo)下,killer NPs在體內(nèi)可以與CD8~+T細(xì)胞直接接觸,并且在CD47-Fc分子保護(hù)下被巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞吞噬的現(xiàn)象較少。6、殺傷性PLGA納米粒治療對(duì)機(jī)體整體免疫功能的影響和毒副作用:在killer NPs第三次治療后2天,流式分析顯示移植鼠脾細(xì)胞群中CD3~+T細(xì)胞、CD4~+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的頻率未明顯下降;混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示受者T細(xì)胞對(duì)第三方脾細(xì)胞的同種增殖能力沒有明顯下降;細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)顯示NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的非特異性殺傷活性也沒有下降;移植鼠載瘤實(shí)驗(yàn)顯示killer NPs治療并未顯著降低治療鼠的整體抗腫瘤能力。在killer NPs末次治療后第2、17和32天,移植鼠血常規(guī)檢測顯示外周血中8種細(xì)胞群的數(shù)量或比例未有明顯下降;生化指標(biāo)分析顯示肝功能和腎功能也未受明顯損傷;各器官組織切片的HE染色結(jié)果顯示移植鼠的脾、腎、肝、心和肺等重要臟器未見明顯病理損傷。這些結(jié)果初步提示:killer NPs的體內(nèi)治療未導(dǎo)致移植鼠其他免疫細(xì)胞種群的明顯的非特異性殺傷,未導(dǎo)致移植鼠整體免疫功能的明顯下降和主要臟器的可見的毒副作用。結(jié)論:在PLGA納米粒表面負(fù)載靶向抗原、多種負(fù)免疫調(diào)節(jié)分子和抗吞噬分子,成功制備直徑200nm的、可生物降解的、多效能的殺傷性PLGA納米粒。其經(jīng)血液循環(huán)分布于同種皮膚移植鼠體內(nèi)多種組織器官,在淋巴器官與同種抗原反應(yīng)性CD8~+T細(xì)胞直接接觸,誘導(dǎo)其凋亡、抑制其活化和同種增殖能力,促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖,導(dǎo)致移植鼠體內(nèi)大多數(shù)同種抗原反應(yīng)性CD8~+T細(xì)胞被選擇性清除,移植物局部浸潤大幅減少,從而有效抑制皮膚移植排斥,大幅延長移植物存活期,同時(shí)對(duì)機(jī)體其他免疫細(xì)胞、整體免疫功能和主要臟器未見明顯的毒副作用。本研究為同種異體移植排斥的特異性免疫療法提供了新的策略和思路。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2611443