【摘要】：本論文主要分兩個(gè)章節(jié),第一章節(jié)重點(diǎn)研究了鋅指蛋白BCL11A負(fù)調(diào)控Y-珠蛋白表達(dá)的分子機(jī)制;第二章節(jié)主要研究了人源BAF180蛋白質(zhì)第一個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)以及其與核小體的相互作用。第一章節(jié):血紅蛋白的主要作用是將氧氣運(yùn)輸?shù)缴眢w的各個(gè)組織和器官,來(lái)維持人類正常的生命活動(dòng)。血紅蛋白由兩條α類型和兩條β類型的亞基組成,其編碼基因分別位于人類第16號(hào)和11號(hào)染色體上。β類型的亞基由5個(gè)不同的珠蛋白基因(ε-,Gγ-,Aγ-,δ-,和β-珠蛋白)編碼,并且在胚胎發(fā)育過(guò)程中會(huì)經(jīng)過(guò)兩次發(fā)育轉(zhuǎn)換。在胚胎期,主要表達(dá)ε-珠蛋白;胎兒期,主要表達(dá)γ-珠蛋白;成人期,主要表達(dá)β-珠蛋白和δ-珠蛋白。此時(shí),胎兒血紅蛋白(HbF或者α2 γ2)的水平降到1%以下。β-血紅蛋白疾病是由于編碼β-珠蛋白的基因發(fā)生突變導(dǎo)致β-珠蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生異�；蚝铣僧惓�,包括鐮刀型貧血癥和β-地中海貧血癥。目前,β-血紅蛋白疾病治療方案有羥基脲(hydroxyurea)治療、輸血治療、骨髓移植和基因治療�；加小斑z傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在癥(HPFH綜合癥)”的病人沒(méi)有完成正常的珠蛋白轉(zhuǎn)換,因此血液中仍然含有一定比例的胎兒血紅蛋白。對(duì)于正常人來(lái)說(shuō),這種HPFH綜合癥對(duì)他們的健康狀況沒(méi)有顯著影響,但是對(duì)于患有β-血紅蛋白疾病的患者,卻能夠極大地緩解他們的癥狀。因此重激活Y-珠蛋白的表達(dá)可以作為一種治療β-血紅蛋白疾病的策略。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BCL11A在調(diào)控γ-珠蛋白表達(dá)上起著重要的作用。在人類造血干/祖細(xì)胞CD34+細(xì)胞中敲除BCL11A,γ-珠蛋白表達(dá)明顯上升;在患有鐮刀型貧血癥的小鼠中,通過(guò)條件型敲除BCL11A的表達(dá),可以提高小鼠體內(nèi)Y-珠蛋白的產(chǎn)量,也可以修正小鼠的表型。盡管大量的功能實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)BCL11A可以調(diào)控γ-珠蛋白的表達(dá),但是具體的分子機(jī)制仍然還不清楚。直到最近,兩個(gè)課題組同時(shí)報(bào)道BCL11A通過(guò)其C端的三個(gè)串聯(lián)的C2H2鋅指結(jié)合γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子上游的115bp區(qū)域。巧合的是,天然突變G-117A以及C-1 14A/T/G位于該區(qū)域內(nèi)并且被鑒定存在于患有HPFH綜合癥的病人體內(nèi),但是這些天然突變對(duì)于負(fù)調(diào)控γ-珠蛋白的表達(dá)機(jī)制也還不清楚。我們通過(guò)體外克隆表達(dá)以及純化獲得了 BCL11A的C端三個(gè)串聯(lián)的鋅指Znf4-6,并設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的DNA序列用于后續(xù)的結(jié)晶實(shí)驗(yàn),最終獲得了 2.50 A的BCL11A和12bp的DNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析以及ITC滴定實(shí)驗(yàn),我們驗(yàn)證了 G-117A和C-114A/T/G突變能夠極大地減弱了 BCL11A和DNA的親和力,這與晶體結(jié)構(gòu)中Znf4-5與G-117以及G-114之間存在相互作用一致。我們也通過(guò)ITC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 ZBTB7A蛋白的C端四個(gè)串聯(lián)的鋅指可以結(jié)合在γ-珠蛋白基因啟動(dòng)子上游200bp區(qū)域,親和力約為120 nM,該區(qū)域內(nèi)也存在一些與HPFH綜合癥相關(guān)的點(diǎn)突變,目前正在進(jìn)行后續(xù)研究。第二章節(jié):染色質(zhì)重塑作為表觀遺傳調(diào)控的重要組成成分,主要依賴于染色質(zhì)重塑復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)功能,主要包括SWI/SNF蛋白家族、ISWI蛋白家族、CHD蛋白家族和INO80蛋白家族。在人類細(xì)胞中,SWI/SNF家族又可以分為BAF和PBAF兩個(gè)蛋白質(zhì)亞家族。BAF180是PBAF亞家族中獨(dú)有的亞基,在維持基因組穩(wěn)定、促進(jìn)哺乳動(dòng)物心腔成熟、DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的損傷修復(fù)以及抑制乳腺癌、腎細(xì)胞癌等起著重要的作用。BAF180含有6個(gè)Bromo結(jié)構(gòu)域、2個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域和1個(gè)HMG box結(jié)構(gòu)域。其中它的6個(gè)Bromo結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被解析,而C末端的HMG box結(jié)構(gòu)域的功能主要是參與結(jié)合DNA,但是關(guān)于BAH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)以及功能尚未有文章報(bào)道。之前文章報(bào)道BAH結(jié)構(gòu)域可以參與識(shí)別組蛋白翻譯后修飾來(lái)調(diào)控基因的表達(dá);也可以參與結(jié)合核小體來(lái)調(diào)控基因沉默;也可以參與蛋白-蛋白相互作用。因此探究BAF180的BAH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)于理解BAF180的生物學(xué)功能具有很重要的意義。我們解析了 BAF180的第一個(gè)BAH結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu),并通過(guò)體外組裝核小體,利用GST pull-down、EMSA以及ITC實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 BAH結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合體外組裝的核小體,也能與293T細(xì)胞中提取的核小體相互作用。通過(guò)大量的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)和核磁滴定實(shí)驗(yàn),我們初步鑒定了 BAH結(jié)構(gòu)域與核小體相互作用的界面信息。我們希望通過(guò)后續(xù)的核磁滴定實(shí)驗(yàn),能夠獲得核小體上的作用界面信息,從而搭建結(jié)構(gòu)模型,獲得BAH結(jié)構(gòu)域與核小體的三維結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

邋血紅蛋白轉(zhuǎn)換（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ邋ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）逡逑編碼ａ類型的珠蛋白基因位于人類第１６號(hào)染色體的同一個(gè)基因座上，ａ－珠蛋白，其中ａ－珠蛋白基因在每條染色體上有兩個(gè)拷貝，它們的表達(dá)端調(diào)控序列（ｌｏｃｕｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｒｅｇｉｏｎ，邋ＬＣＲ）所調(diào)控。編碼Ｐ類型的珠蛋白人類第１１號(hào)染色體的同一個(gè)基因座上，包含ｓ－，ＧＹ－，ＡＹ＿，邋＆和Ｐ－珠蛋、－和珠蛋白是Ｙ－珠蛋白基因的兩個(gè)拷貝，它們的主要差別在于丫－因的第１３６位氨基酸上的差異，ＡＹ－珠蛋白基因的第１３６位氨基酸是丙氨ｙ－珠蛋白是甘氨酸，它們的表達(dá)同樣受５’端調(diào)控序列所調(diào)控（Ｂｌｏｂｅｌｅｔａｌ．，２ｅｒｔ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１８）。編碼ｃｔ類型和Ｐ類型的珠蛋白基因在發(fā)育過(guò)程中受到錄調(diào)控，其中Ｐ類型的珠蛋白需要經(jīng)歷兩次發(fā)育轉(zhuǎn)換，該過(guò)程被稱為血換（圖１．１．２）。在懷孕早期（胚胎時(shí)期），血紅蛋白主要由＆和ｓ－珠蛋白２），此時(shí)珠蛋白在卵黃囊中合成；懷孕三個(gè)月至出生前（胎兒時(shí)期），主要由ａ－和ｙ－珠蛋白組成（ｃｔ２Ｙ２），此時(shí)珠蛋白在胚胎肝中合成；出生后

．，２０１１；邋Ｌｏｈａｎｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１８；邋Ｓａｎｋａｒａｎ邋ａｎｄ邋Ｎａｔｈａｎ，邋２０１０；邋Ｓａｎｋａｒａｎ邋ａｎｄ邋ｉｎｊａｍｕｒｅｔａｌ．，２０１８；Ｗｉｅｎｅｒｔｅｔａｌ．，２０１８）。ｙ－珠蛋白和邋ｐ－珠蛋白的氨間結(jié)構(gòu)都非常的相似，都是由１４６個(gè)氨基酸組成。但是編碼丫－珠蛋３位氨基酸是絲氨酸，而在Ｐ－珠蛋白基因的相應(yīng)位置是組氨酸。這－珠蛋白與結(jié)合在血紅蛋白上的２，３－二磷酸甘油酸（２，３－１）＿１１（＾ｔｅ，ＢＰＧ）分子結(jié)合部位的正電荷減少，也即降低了邋ｙ－珠蛋白對(duì)２，３－的親和力。２，３－二磷酸甘油酸是血紅蛋白的一個(gè)重要的別構(gòu)效應(yīng)物，白可以結(jié)合一分子的２，３－二磷酸甘油酸。２，３－二磷酸甘油酸是一個(gè)子，，能夠與Ｐ－珠蛋白的第８２位賴氨酸、第２位的組氨酸、第１４３第１位纈氨酸的Ｎ末端的正電荷存在靜電相互作用而被錨定在血成的空穴中。結(jié)合了邋２，３－二磷酸甘油酸的血紅蛋白對(duì)氧氣親和力要下要低，因此胎兒時(shí)期的血紅蛋白載氧能力要比成人時(shí)期的血紅蛋能維持胎兒在母親體內(nèi)能夠獲得足夠的氧氣維持自己的生存需求。，他們能夠自主進(jìn)行呼吸，所以不再需要從母親那里獲取氧氣來(lái)滿所以胎兒血紅蛋白ＨｂＦ需要降低到很低的水平。逡逑｜Ａ｜邐ＨＳ－４０邐？？邐ａ２邋ａ＿ｌ邐ａ－ａｌｏｂｉｎ邋ｌｏｃｕｓ逡逑＇＂
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2611322