【摘要】：目的:檢測(cè)γ-氨基丁酸A型受體β3亞基(Gamma-aminobutyric acid type A receptor beta3 subunit,GABRB3)在環(huán)境污染物2,3,7,8-四氯二苯并二VA英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)誘導(dǎo)C57BL/6J胎鼠腭裂模型中的表達(dá)情況,探究GABRB3與TCDD誘導(dǎo)的先天性腭裂的關(guān)系。方法:將60只C57BL/6J孕鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組30只。妊娠第10.5天(Gestation Day10.5,GD10.5)實(shí)驗(yàn)組以28μg/kg劑量的TCDD單次灌胃,對(duì)照組以5.6ml/kg劑量的玉米油單次灌胃。分別在GD13.5、GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5進(jìn)行胎鼠腭部大體形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察;應(yīng)用Q-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)GABRB3在不同妊娠時(shí)期的胎鼠腭組織中mRNA和蛋白的表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測(cè)GABRB3蛋白在腭組織上的表達(dá)定位。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組共獲164只活胎鼠,均發(fā)生腭裂(100%);對(duì)照組共獲188只活胎鼠,均無(wú)腭裂發(fā)生(0%)。較對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組胎鼠腭架上抬延遲1天。GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5實(shí)驗(yàn)組中GABRB3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P0.05)。對(duì)照組GD14.5、GD15.5、GD16.5、GD17.5中GABRB3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于該組GD13.5(P0.05),實(shí)驗(yàn)組GD15.5、GD16.5中GABRB3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于該組GD13.5、GD14.5(P0.05)。免疫組織化學(xué)和免疫熒光結(jié)果顯示,GABRB3主要表達(dá)于腭突間質(zhì)細(xì)胞和腭突中嵴上皮縫。結(jié)論:采用28μg/kg劑量的TCDD成功建立了C57BL/6J胚胎鼠腭裂模型,證實(shí)了TCDD誘導(dǎo)腭裂的高效性和穩(wěn)定性。TCDD誘導(dǎo)胎鼠腭架上抬延遲并最終導(dǎo)致腭裂發(fā)生可能與GABRB3表達(dá)降低有關(guān);GABRB3可能在腭部發(fā)育的上抬和融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖 1 不同妊娠時(shí)期對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組胎鼠腭部發(fā)育形態(tài)圖（20×）Figure 1 Gross morphology in control group and experimental group at different pregnancystage (20×)2.3 C57BL/6J 小鼠不同妊娠時(shí)期胎鼠頭組織冠狀位 HE 染色HE 染色進(jìn)行腭組織學(xué)觀察，對(duì)照組 GD13.5 胎鼠的雙側(cè)腭突垂直于舌部?jī)蓚?cè)（圖 2A），GD14.5 腭突位于舌部上方開(kāi)始呈水平方向生長(zhǎng)（圖 2B）；GD15.5 腭突于中線處發(fā)生融合，可見(jiàn)未完全消失的腭突中嵴上皮縫（圖 2C）；GD16.5 腭融合完全未見(jiàn)上皮縫且在融合的腭部中上部可見(jiàn)明顯細(xì)胞聚集（圖 2D）；GD17.5 形成完整上腭分隔口鼻腔（圖 2E）。然而，在 TCDD 作用下的實(shí)驗(yàn)組，GD14.5 雙側(cè)腭突仍垂直于舌部?jī)蓚?cè)（圖 2G）；至 GD15.5 時(shí)雙側(cè)腭突位于舌部上方水平位置，在中線處靠近但未發(fā)生融合（圖 2H），，實(shí)驗(yàn)組胎鼠腭架上抬至舌面上方較對(duì)照組延遲 1 天；GD16.5 雙側(cè)腭突裂隙加寬（圖 2I）；GD17.5 形成腭裂（圖 2J）。

N 為鼻部；T 為舌部；P 為腭突圖 2 不同妊娠時(shí)期對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組胎鼠腭部 HE 染色圖（100×）N:nose；T:tongue；P:palateFigure 2 Hematoxylin and eosin staining in control group and experimental group at differentpregnancy stage (100×)2.4 Q-PCR 檢測(cè) GABRB3 mRNA 在不同妊娠天數(shù)（GD）胎鼠腭組織中的表達(dá)水平2.4.1 引物的最適溫度和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果在本研究中 GABRB3 引物的最適溫度為 52℃，并以 10 倍濃度梯度稀釋為最適溫度產(chǎn)物，其稀釋產(chǎn)物作為 cDNA 模板繪制 GABRB3 引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 3-1，3-2），GABRB3 引物擴(kuò)增效率為 102.4%，線性回歸系數(shù) R2=0.99，溶解曲線為單峰，特異性良好，有可信度，可用于進(jìn)一步的 Q-PCR 技術(shù)檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R782.2;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2611003