發(fā)布時(shí)間：2020-04-01 17:40

【摘要】：研究背景:天然免疫反應(yīng)的不足或過(guò)強(qiáng),均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體引發(fā)嚴(yán)重疾病。例如,模式識(shí)別受體(PRRs)通路的交叉調(diào)節(jié)一定程度保障了機(jī)體能夠準(zhǔn)確有效的識(shí)別和應(yīng)對(duì)外源和自身的危險(xiǎn)信號(hào),但是在某些條件下,不適當(dāng)?shù)腜RRs的激活或缺失會(huì)造成機(jī)體嚴(yán)重的炎癥疾病和自身免疫疾病,如Toll樣受體(TLR)和維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體(RLR)介導(dǎo)的通路失調(diào)會(huì)引起腸炎和心肌炎的發(fā)生,黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)功能性突變能夠促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生。而維持適度的天然免疫反應(yīng),機(jī)體需要受到包括表觀遺傳修飾,轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),以及代謝調(diào)節(jié)在內(nèi)的多因子的精準(zhǔn)協(xié)同調(diào)控。目的:為使機(jī)體能夠在避免自身免疫性疾病的同時(shí)迅速有效地清除入侵病原體,我們需要著力研究并努力解決以下兩個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題。1.尋找并鑒定新的天然免疫關(guān)鍵調(diào)控基因;2.揭示天然免疫網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)控的作用機(jī)制。以期通過(guò)以上研究,加深大家對(duì)精細(xì)而復(fù)雜的免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)并提供抗感染及免疫疾病治療藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)和科學(xué)依據(jù)。方法:1.運(yùn)用si RNA干擾技術(shù)瞬時(shí)敲減蛋白表達(dá),構(gòu)建基因表達(dá)實(shí)時(shí)效應(yīng)檢測(cè)模型。2.運(yùn)用crispr/cas9敲除技術(shù),敲除具體基因并構(gòu)建具有穩(wěn)定表型的細(xì)胞系。3.采用q PCR和WB等方法來(lái)檢測(cè)特定蛋白瞬時(shí)敲減和穩(wěn)定敲除后的細(xì)胞天然免疫相關(guān)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的變化,篩選出新的免疫調(diào)控因子并闡明其功能。4.以單純皰疹病毒HSV-1感染為模型進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的天然免疫調(diào)控因子的功能。結(jié)果:1.PUM1敲減能顯著抑制單純皰疹病毒(HSV-1)的復(fù)制。2.細(xì)胞內(nèi)源PUM1能介導(dǎo)自身天然免疫相關(guān)基因表達(dá)的抑制。3.PUM1敲減能誘導(dǎo)天然免疫相關(guān)基因表達(dá),其表達(dá)呈現(xiàn)兩種不同時(shí)序表達(dá)特點(diǎn),且LGP為關(guān)鍵調(diào)控蛋白。4.PUM1敲減對(duì)HSV-1復(fù)制的抑制依賴于干擾素β的產(chǎn)生。5.PUM2的敲減既不影響天然免疫相關(guān)基因表達(dá)也不影響HSV-1的復(fù)制。6.LGP2,HDAC4或PML基因的單個(gè)敲除能上調(diào)部分交叉重疊天然免疫相關(guān)基因的表達(dá),同時(shí)它們的敲除均能抑制HSV-1的復(fù)制。7.IRF3,STING,LSD1,MDA5或HDAC1基因的單個(gè)敲除能下調(diào)部分交叉重疊天然免疫相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá),但不影響HSV-1的復(fù)制。8.PUM1和IFI16敲除對(duì)天然免疫相關(guān)基因的表達(dá)和HSV-1復(fù)制均沒(méi)有影響。9.基因敲除細(xì)胞間交叉重疊天然免疫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控呈現(xiàn)出部分依賴IRF3蛋白功能的特點(diǎn)。10.PUM1的瞬時(shí)敲減和穩(wěn)定敲除影響細(xì)胞不同基因網(wǎng)絡(luò)表達(dá),并呈現(xiàn)不同的細(xì)胞表型。結(jié)論:1.PUM1蛋白具有負(fù)向調(diào)控天然免疫相關(guān)基因表達(dá)的新功能,其調(diào)控通路依賴于對(duì)LGP2蛋白的抑制作用。2.天然免疫網(wǎng)絡(luò)中不同基因的敲除能造成相同效應(yīng)因子的表達(dá)改變。3.天然免疫基因的功能受到的是整個(gè)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同調(diào)控,其對(duì)細(xì)胞表型的影響不能僅歸結(jié)于該基因本身,而應(yīng)取決于下游效應(yīng)因子變化的總和。4.si RNA瞬時(shí)敲減能作為細(xì)胞內(nèi)源基因效應(yīng)表達(dá)的實(shí)時(shí)檢測(cè)模型。5.不同于si RNA敲減的瞬時(shí)效應(yīng),基因敲除通過(guò)細(xì)胞基因組或表觀遺傳修飾的改變來(lái)誘導(dǎo)不同基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)進(jìn)而賦予細(xì)胞代償性的穩(wěn)定表型。
【圖文】：

圖 3.1. PUM1 在病毒感染后細(xì)胞的表達(dá)和定位情況Fig 3.1.Accumulation and cellular localization of PUM1 in HEp-2 cells infected with HSV-1HEp-2 cells grown on four-well slides were mock infected or exposed to10 pfu HSV-1 per cell. At3 h，6 h, or 12 h after infection, the cells were fixed and reacted with antibody to PUM1(green)and ICP8(red). (magnification:63x).

圖 3.1. PUM1 在病毒感染后細(xì)胞的表達(dá)和定位情況Fig 3.1.Accumulation and cellular localization of PUM1 in HEp-2 cells infected with HSV-1HEp-2 cells grown on four-well slides were mock infected or exposed to10 pfu HSV-1 per cell. At3 h，6 h, or 12 h after infection, the cells were fixed and reacted with antibody to PUM1(green)and ICP8(red). (magnification:63x).
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2610760