【摘要】：目的:鮑曼不動桿菌是臨床常見耐藥菌,多重/泛耐藥鮑曼不動桿菌所導(dǎo)致的感染已成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題,但對于鮑曼不動桿菌毒力機制研究卻少見。莢膜是細菌的重要毒力因子,可以發(fā)揮保護細菌并抵抗宿主免疫細胞吞噬清除的功能,但目前尚未見鮑曼不動桿菌莢膜的毒力機制研究。本研究擬通過不同莢膜厚度鮑曼不動桿菌以及提純的莢膜多糖與鼠巨噬細胞(Raw 264.7細胞)相互作用,探討鮑曼不動桿菌莢膜誘導(dǎo)鼠巨噬細胞自噬和凋亡機制。方法:1.根據(jù)鮑曼不動桿菌和其他不動桿菌16S rRNA基因中特異性序列設(shè)計引物,建立多重PCR法鑒定鮑曼不動桿菌和其他不動桿菌。2.采用剛果紅染料染色鮑曼不動桿菌,在油鏡下觀察鮑曼不動桿菌莢膜厚度,建立一種快速簡便方法鑒別鮑曼不動桿菌莢膜厚度。挑取兩株莢膜厚度差異明顯的鮑曼不動桿菌,即厚莢膜株(Ab-H株)和薄莢膜株(Ab-B株)用于后續(xù)研究。3.血平板上分別培養(yǎng)Ab-H株和Ab-B株,經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后收集血平板上菌苔。加入細菌中細菌裂解液,并結(jié)合超聲裂解細菌,收集裂解后上清加入終濃度為1%三甲基十六烷基溴化銨(CTAB)溶液第一次沉淀莢膜多糖,沉淀以1 mol/L CaCl_2溶液重新溶解,以80%乙醇再次沉淀莢膜多糖,沉淀最終以無水乙醇反復(fù)洗滌后即為鮑曼不動桿菌莢膜多糖提取物。所提取莢膜多糖經(jīng)苯酚-濃硫酸法測定濃度,鱟試劑法檢測內(nèi)毒素含量,并通過LC-MS法分析莢膜多糖成分。4.分別以鮑曼不動桿菌Ab-H株和Ab-B株以及不同濃度純化莢膜多糖與Raw264.7細胞共培養(yǎng)1 h、3 h和6 h,采用實時熒光定量PCR法檢測共培養(yǎng)不同時間Raw 264.7細胞自噬相關(guān)基因Atg3、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、Atg16L1、GABARAPL1和ULK1表達量,采用Western blotting法檢測共培養(yǎng)不同時點Raw264.7細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Atg12、Beclin-1和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達量,AnnexinV-FITC/PI法檢測共培養(yǎng)不同時點Raw 264.7細胞凋亡率。5.分別以鮑曼不動桿菌Ab-H株和Ab-B株以及不同濃度的純化莢膜多糖與Raw264.7細胞共培養(yǎng)1 h、3 h和6 h,分別采用實時定量PCR法檢測共培養(yǎng)不同時間Raw 264.7細胞TLR2、TLR4、NLRP3和IL-1β基因表達量,流式細胞術(shù)檢測活性氧(ROS)表達量,Western blotting法檢測PI3K、Akt和mTOR磷酸化蛋白表達量,探討鮑曼不動桿菌莢膜誘導(dǎo)Raw 264.7細胞自噬和凋亡機制。結(jié)果:1.經(jīng)多重PCR法擴增,鮑曼不動桿菌可以獲得兩條帶分別為425bp和208bp;而其他不動桿菌僅有一條為425bp。經(jīng)基因測序分析208bp條帶為鮑曼不動桿菌特異性條帶,425bp條帶為不動桿菌所共有條帶,與預(yù)期一致。我院經(jīng)VITEK 2Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復(fù)合體中,98%菌種確認為鮑曼不動桿菌。2.鮑曼不動桿菌以剛果紅染料染色后,油鏡下可見細菌被成紫色,整個背景為淡紅色,細菌莢膜不著色,極易辯識。所檢測菌株中,細菌莢膜厚度并不相同,挑取兩株莢膜厚度差異顯著的菌株,即厚莢膜株(Ab-H)和薄莢膜株(Ab-B)用于后續(xù)研究。3.本研究中提取鮑曼不動桿菌Ab-H株和Ab-B株莢膜多糖濃度分別為127.593μg/mL和30.047μg/mL,經(jīng)鱟試劑法檢測內(nèi)毒素含量為0.01 EU/mL,經(jīng)LC-MS分析兩株鮑曼不動桿菌莢膜多糖成分相同。4.鮑曼不動桿菌Ab-H株和Ab-B株,以及純化的莢膜多糖均可以誘導(dǎo)Raw 264.7細胞自噬和凋亡。鮑曼不動桿菌與Raw 264.7細胞共培養(yǎng)后,細胞LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表達量持續(xù)升高,且Ab-H組升高趨勢高于Ab-B組(p0.01),Raw 264.7細胞凋亡趨勢與細胞自噬相同;純化莢膜也可以誘導(dǎo)Raw 264.7細胞自噬和凋亡,且誘導(dǎo)的自噬和凋亡強度與莢膜多糖濃度成正比。5.鮑曼不動桿菌和莢膜多糖均可以誘導(dǎo)Raw 264.7細胞表達活性氧,Ab-H組活性氧表達量高于Ab-B組(p0.01),莢膜多糖誘導(dǎo)Raw 264.7細胞表達活性氧能與濃度成正相關(guān)。6.鮑曼不動桿菌和莢膜多糖均可以抑制Raw 264.7細胞PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化,Ab-B組Raw 264.7細胞磷酸化蛋白pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白表達量高于Ab-H組(p0.01);莢膜多糖誘導(dǎo)Raw 264.7細胞磷酸化蛋白pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白表達量與濃度成負相關(guān)。結(jié)論:鮑曼不動桿菌及其莢膜均能誘導(dǎo)Raw 264.7細胞自噬和凋亡,莢膜是誘導(dǎo)Raw 264.7細胞自噬和凋亡的重要毒力因子,其誘導(dǎo)能力與其濃度成正相關(guān)。鮑曼不動桿菌誘導(dǎo)Raw 264.7細胞自噬和凋亡可能是莢膜誘導(dǎo)Raw 264.7細胞產(chǎn)生大量活性氧并抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路,最終引起Raw 264.7細胞自噬和凋亡。
【圖文】：

圖 2.4.1 不動桿菌/鮑曼不動桿菌鑒定entification of Acinetobacter and Acinetobacarker、1-不動桿菌、2-鮑曼不動桿菌、3膜多糖染色結(jié)果膜多糖經(jīng)過剛果紅染色后，整個背景色，而其周圍莢膜則會因為不著色呈膜厚度不同（見圖 2.4.2）。

圖 2.4.1 不動桿菌/鮑曼不動桿菌鑒定Fig 2.4 .1 Identification of Acinetobacter and Acinetobacter BaumanniiM-DNA Marker、1-不動桿菌、2-鮑曼不動桿菌、3-空白對照 鮑曼不動桿菌莢膜多糖染色結(jié)果曼不動桿菌莢膜多糖經(jīng)過剛果紅染色后，整個背景會被染成淡淡體會被染成紫色，而其周圍莢膜則會因為不著色呈無色透明狀，，并菌體周圍的莢膜厚度不同（見圖 2.4.2）。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 錢雪琴;范小勇;蔣曉飛;;墨汁染色在肺泡灌洗液隱球菌檢測中的應(yīng)用[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2014年15期

2 劉丹;王培昌;趙霞;王力紅;張京麗;白淑媛;張麗麗;王育英;張紅艷;;RAPD、ERIC-PCR聯(lián)合REP-PCR對多重耐藥鮑曼不動桿菌基因型的鑒定[J];山東醫(yī)藥;2010年40期

本文編號：2610691