【摘要】：表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR、HER1或ErbB1)是酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族的一個成員。EGFR的過度表達(dá)或突變可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和抗凋亡,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后高度相關(guān),是惡性腫瘤靶向治療的熱門靶點(diǎn)之一。針對該靶點(diǎn)的上市抗體類藥物存在臨床反應(yīng)率低下(10-25%)和耐藥問題,這可能與EGFR受體胞外區(qū)高度易變、與家族其它成員受體間異源二聚化、以及配體的競爭性抑制有關(guān)。二聚化是EGFR家族受體活化的必經(jīng)過程,并且直接參與二聚化的界面是高度保守的區(qū)域。因此,我們提出了EGFR二聚體界面靶向策略,意圖解決通過這種靶向策略抗體解決由于受體突變和異源二聚化等原因帶來的臨床反應(yīng)率低下和耐藥問題。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中采用來自EGFR二聚體界面直接參與二聚化的β-環(huán)多肽制備了靶向EGFR二聚體界面的多肽疫苗和單克隆抗體EGFR dimer 5G9,并初步證明二者可有效抑制EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的生長。為了進(jìn)一步評價EGFR二聚體界面靶向策略的可行性,本研究以來自EGFR dimer 5G9的可變區(qū)構(gòu)建了單鏈抗體EGFR dimer ScFv,觀察了二類分子大小不同抗體對不同受體表型腫瘤細(xì)胞的體外生長抑制作用、抗受體同源和異源二聚化能力、抗受體磷酸化能力、以及人表皮癌A431移植瘤摸型實(shí)驗(yàn)療效,以期為新型抗EGFR治療性抗體的研發(fā)打下基礎(chǔ)。研究內(nèi)容:1.靶向EGFR二聚體界面的單鏈抗體EGFR dimer ScFv的構(gòu)建與高效制備;2.腫瘤細(xì)胞受體表型鑒定;3.單克隆抗體與單鏈抗體體外抑瘤活性觀察;4.單克隆抗體與單鏈抗體抗受體二聚化研究;5.單克隆抗體與單鏈抗體抗受體磷酸化研究;6.單克隆抗體裸鼠人表皮癌A431移植瘤實(shí)驗(yàn)療效觀察。研究方法:1.單鏈抗體EGFR dimer ScFv的構(gòu)建、表達(dá)與制備通過基因測序的方法得到EGFR dimer 5G9的可變區(qū)序列,并用(Gly_4-Ser)_3連接肽將VH和VL連接。引入MF-α信號肽、His-tag和酶切位點(diǎn),并經(jīng)過雙酶切后連接進(jìn)表達(dá)載體pGAPZα-A。而后,重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主畢赤酵母X-33,經(jīng)高抗性篩選和表達(dá)篩選,得到工程菌。工程菌在30℃、180 rpm條件下,搖瓶發(fā)酵72 h。發(fā)酵上清經(jīng)硫酸銨沉淀法粗純抗體,而后通過鎳柱精純抗體,并用G25分子篩置換緩沖液為西妥昔處方溶劑,BCA法測定蛋白濃度,并按照1 mg/mL濃度稀釋,分裝于無菌西林瓶中,4℃保存,1-2個月。2.腫瘤細(xì)胞受體表型鑒定選取人表皮癌A431、人胰腺癌BxPC-3和鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至豐度為80%時,用NP-40裂解液(含10mmol/L PMSF)冰浴裂解細(xì)胞30 min。而后渦旋振蕩并離心,上清經(jīng)BCA法半定量后,按照1 mg/mL濃度稀釋。而后,加入上樣緩沖液,進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳和Western Blotting分析,檢測EGFR、HER2和HER3的表達(dá)情況。3.單克隆抗體與單鏈抗體體外抑瘤活性觀察選取EGFR/HER2過表達(dá)的A431細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至豐度為80%時,消化細(xì)胞種于96孔板內(nèi),用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。而后,在1.12μmol/L的EGF刺激下,用不同濃度的抗體與A431細(xì)胞共孵育,進(jìn)行無血清培養(yǎng)48 h,并用MTT法檢測增殖情況,計算抑制率以觀察抗體量效關(guān)系。用2.136μmol/L給藥濃度,檢測抗體在相同條件下,對NIH-3T3和BxPC-3細(xì)胞的體外48 h抑制情況。以溶劑為陰性對照,西妥昔為陽性對照。4.單克隆抗體與單鏈抗體抗受體二聚化研究選取EGFR/HER2過表達(dá)的A431和EGFR/HER2/HER3過表達(dá)的BxPC-3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長至豐度80%后,消化細(xì)胞種于6孔板中,用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。而后,對細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓24 h。在1.12μmol/L EGF刺激下,用2.136μmol/L抗體與細(xì)胞共孵育不同時間(2 h和12 h)。而后,用BS~3交聯(lián)劑原位耦聯(lián)二聚體,以固定二聚體。NP-40裂解液(含蛋白酶磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞,渦旋振蕩并離心,上清用BCA法進(jìn)行半定量,濃度稀釋至1 mg/mL。進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳和Western Blotting分析,檢測同源二聚體和異源二聚體情況,以及磷酸化的同源二聚體和異源二聚體情況。5.單克隆抗體與單鏈抗體抗受體磷酸化研究選取EGFR/HER2過表達(dá)的A431和EGFR/HER2/HER3過表達(dá)的BxPC-3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長至豐度80%后,消化種于6孔板中,用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。而后,對細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓24 h。在1.12μmol/L EGF刺激下,用2.136μmol/L抗體與細(xì)胞共孵育不同時間(2 h和12 h)。而后,用NP-40裂解液(含蛋白酶磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞。渦旋振蕩并離心,上清用BCA法進(jìn)行半定量,濃度稀釋至1 mg/mL。進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳和Western Blotting分析,檢測EGFR、HER2和HER3總蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)情況。6.單克隆抗體裸鼠人表皮癌A431移植瘤實(shí)驗(yàn)療效觀察用A431細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型,設(shè)陰性對照組(溶劑)、實(shí)驗(yàn)組(EGFR dimer 5G9)和陽性對照組(西妥昔),每組各9只。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm~3時,按照25 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射給藥,每3天給藥1次,共6次。每3天記錄1次腫瘤體積和小鼠體重,并繪制成生長曲線。在給藥結(jié)束后第九天,處死小鼠并對腫瘤組織拍照和稱重。研究結(jié)果:1.單鏈抗體EGFR dimer ScFv的構(gòu)建、表達(dá)與制備結(jié)果顯示,用畢赤酵母X-33高效分泌表達(dá)了EGFR dimer ScFv。SDS-PAGE和Western Blotting分析顯示,抗體經(jīng)鎳柱純化在29.0 kDa附近有His標(biāo)簽特異性的目的條帶,純度99.5%。2.腫瘤細(xì)胞受體表型鑒定Western Blotting分析顯示,NIH-3T3為EGFR/HER2/HER3正常表達(dá)或低表達(dá)細(xì)胞,A431為EGFR/HER2過表達(dá),HER3低表達(dá)細(xì)胞,BxPC-3為EGFR/HER2/HER3過表達(dá)細(xì)胞。3.單克隆抗體與單鏈抗體體外抑瘤活性觀察MTT分析結(jié)果顯示,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv能顯著的抑制A431細(xì)胞生長,且抑制率呈現(xiàn)劑量依賴。在2.136μmol/L的濃度時,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv的抑制率相近,分別為47.09±0.94%和48.92±0.31%。在2.136μmol/L的抗體濃度下,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv對BxPC-3細(xì)胞有顯著的抑制作用,抑制率分別為50.17±0.75%和49.06±0.49%。對NIH-3T3細(xì)胞的抑制率分別為7.19±0.50%和6.81±0.48%。4.單克隆抗體與單鏈抗體抗受體二聚化研究Western Blotting分析結(jié)果顯示,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv分別與細(xì)胞共孵育2 h后,均顯示兩細(xì)胞磷酸化的同源和異源二聚體條帶未見顯著減少;共孵育12 h后,均顯示兩細(xì)胞磷酸化的同源和異源二聚體條帶顯著減少。5.單克隆抗體與單鏈抗體抗受體磷酸化研究Western Blotting分析結(jié)果顯示,EGFR dimer 5G9和EGFR dimer ScFv分別與細(xì)胞共孵育2 h后,均顯示A431細(xì)胞EGFR受體磷酸化條帶顯著減少,A431細(xì)胞HER2磷酸化條帶和BxPC-3細(xì)胞EGFR,HER2,HER3磷酸化條帶未見顯著減少;共孵育12 h后,均顯示兩細(xì)胞EGFR、HER2、HER3磷酸化條帶顯著減少。6.單克隆抗體裸鼠人表皮癌A431移植瘤實(shí)驗(yàn)療效觀察在結(jié)束實(shí)驗(yàn)時,對照組平均腫瘤體積為3082.5±276.1 mm~3,EGFR dimer 5G9組平均腫瘤體積為1726.8±187.6 mm~3。EGFR dimer 5G9組的抑制率為43.98%(P0.01)。從開始接種腫瘤到結(jié)束實(shí)驗(yàn),裸鼠體重未出現(xiàn)顯著下降,未出現(xiàn)死亡情況。在最終結(jié)束實(shí)驗(yàn)時,對照組平均腫瘤濕重為2.33±0.08 g,EGFR dimer5G9組平均腫瘤濕重為1.31±0.13 g。與對照組相比,EGFR dimer 5G9組平均腫瘤濕重顯著小于對照組(P0.001)。研究結(jié)論:1、成功構(gòu)建了基于單克隆抗體EGFR dimer 5G9的單鏈抗體,并采用畢赤酵母組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)建立了高效制備方法。2、靶向EGFR二聚體界面的單克隆抗體和單鏈抗體均可有效抑制EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的生長、受體同源與異源二聚化、以及受體磷酸化,且呈現(xiàn)時間積累效應(yīng)。3、單克隆抗體EGFR dimer 5G9對人表皮癌A431裸鼠移植瘤有顯著生長抑制作用。
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文3圖1-1 表皮生長因子受體(EGFR)家族成員的胞外結(jié)構(gòu)和配體誘導(dǎo)二聚化模型[16]由于在進(jìn)化上 EGFR 二聚體界面區(qū)是高度保守的 β-環(huán)，將該 β-環(huán)作為抗體的靶向位點(diǎn)，就有可能通過抗體的空間障礙作用有效阻止受體的二聚化，且可以大大減少因受體結(jié)構(gòu)易變帶來的耐藥性。此外，由于 EGFR 二聚體界面非配體結(jié)合區(qū)，靶向二聚體界面策略區(qū)域可以避開配體的競爭，獨(dú)立阻斷或作為傳統(tǒng)抗體的第二道屏障來協(xié)同阻斷生長因子信號的向下傳遞。因此，我們提出了靶向高度保守的 EGFR 二聚體界面β-環(huán)的 EGFR 二聚體界面策略，即通過抗體特異性結(jié)合 EGFR 二聚體界面

GTTGGTGTTTACTACTGTGCTCAAAACTTGGAGTTGCCATTGACTTTCGGTGCTGGTACTAAGTTGGAGTTGAAGCACCACCACCACCACCACTGATCTAGAGAGT圖2-1 目的基因MF-α-EGFR dimer ScFv基因擴(kuò)增產(chǎn)物M: DNAMarker DL2000，1: 擴(kuò)增產(chǎn)物。Fig2-1 PCR of EGFR dimer ScFv geneM: DNAMaker DL2000, 1: PCR products.2.4.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化E.coli DH5α目的基因和表達(dá)載體 pGAPZα-A 載體經(jīng) XhoⅠ和 XbaⅠ雙酶切后，用 T4DNA 連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒并命名為 pGAPZα-A-EGFRdimerScFv(圖 2-2)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn) E.coliDH5α 后，涂布在博來霉素抗性的平板上，次日平板上長出的即為轉(zhuǎn)化子(圖2-3)。挑取 16 株菌落進(jìn)行 PCR 鑒定(圖 2-4)，，挑取的菌落大部分都含有目的基因，但
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

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本文編號：2610644