【摘要】：研究背景及意義成體干細(xì)胞源肝細(xì)胞為肝病的治療提供了新思路,其中種子細(xì)胞的獲得和肝功能重塑是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對(duì)于不同成體干細(xì)胞成功誘導(dǎo)功能性肝細(xì)胞的報(bào)道很多,但誘導(dǎo)的低效性大大限制了其臨床應(yīng)用。小涎腺同屬消化道腺體,具有來源廣泛,取材方便與供區(qū)損傷小的優(yōu)點(diǎn),是非常理想的成體干細(xì)胞來源,具有巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力。此外,我課題組進(jìn)行人小涎腺干細(xì)胞研究時(shí)發(fā)現(xiàn),人小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSG-MSCs)表達(dá)較多肝細(xì)胞相關(guān)蛋白,提示hMSG-MSCs可能成為體外快速獲得功能性肝細(xì)胞的種子細(xì)胞。利用人小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行快速體外成肝誘導(dǎo),將為肝病細(xì)胞治療提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。目的1.從人小涎腺組織分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞,對(duì)hMSG-MSCs進(jìn)行鑒定,為體外快速成肝誘導(dǎo)做干細(xì)胞源基礎(chǔ)。2.對(duì)hMSG-MSCs進(jìn)行快速體外成肝誘導(dǎo),并鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表型,檢測最終誘導(dǎo)獲得細(xì)胞是否具有成熟肝臟細(xì)胞相關(guān)功能。方法1.對(duì)人小涎腺組織進(jìn)行原代培養(yǎng),從中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞,體外傳代擴(kuò)增。利用流式細(xì)胞儀對(duì)獲得細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定,并進(jìn)行成骨成脂分化誘導(dǎo)。2.在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下,通過三步法利用CHIR99021、HGF、FGF4、EGF等細(xì)胞誘導(dǎo)因子對(duì)hMSG-MSCs進(jìn)行快速成肝誘導(dǎo),觀察誘導(dǎo)過程中細(xì)胞狀態(tài)及形態(tài)變化,利用Real-time PCR及免疫熒光檢測誘導(dǎo)細(xì)胞相關(guān)表型的表達(dá),并通過PAS染色和ICG攝取檢測最終誘導(dǎo)獲得細(xì)胞相關(guān)成熟肝臟細(xì)胞功能。結(jié)果1.從人小涎腺組織塊中成功分離培養(yǎng)獲得hMSG-MSCs,該細(xì)胞呈紡錘樣(長梭形),體外增殖迅速,且其細(xì)胞特性保存完整。細(xì)胞流式分析表明,獲得的hMSG-MSCs表達(dá)CD29、CD90和CD166等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物,不表達(dá)CD117、CD45等造血干細(xì)胞標(biāo)記,也不表達(dá)CD49f等上皮類細(xì)胞標(biāo)記,并且可成功向骨、脂肪方向進(jìn)行分化。2.在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下,三步法hMSG-MSCs體外成肝誘導(dǎo)共用時(shí)6天。誘導(dǎo)第一天后,80%-90%的細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎趟笮?第二天后細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切?第六天后最終變?yōu)轭惛渭?xì)胞形態(tài)。Real-time PCR顯示,內(nèi)胚系祖細(xì)胞標(biāo)志物F0XA2、S0X17及新生肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP先升高后降低,成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物ALB、CYP3A4和AAT持續(xù)升高。免疫熒光檢測不同階段相關(guān)蛋白陽性表達(dá)。ICG攝取和PAS染色均為陽性。結(jié)論1.由人小涎腺組織可分離培養(yǎng)獲得hMSG-MSCs,該細(xì)胞具有強(qiáng)大自我更新能力和多向分化潛能,可以作為體外快速成肝誘導(dǎo)的種子細(xì)胞。2..hMSG-MSCs在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下通過三步法6天成肝誘導(dǎo),最終所獲得的細(xì)胞為成熟且具有一定功能的肝細(xì)胞。
【圖文】：

圖１－１邋ｈＭＳＧ－ＭＳＣｓ原代及傳代培養(yǎng)逡逑ａ．人小涎腺組織大體觀察；ｈ－ｃ．小涎腺纟ｊＬ織股代培養(yǎng)（ｂ．邋４０Ｘ，ｃ．邋１００Ｘ）；逡逑ｄ－ｅ．邋ｈＭＳＧ－ＭＳＣｓ傳至Ｐ３可獲得形態(tài)均－？的長梭形細(xì)胞（ｄ．邋４０Ｘ，，邋ｅ．邋２００Ｘ），體外十．長逡逑以好，增殖迅速

圖１－３邋ｈＭＳＧ－ＭＳＣｓ多向分化潛能鑒定結(jié)果（ａ、Ｃ為對(duì)照組，ｂ、ｄ為實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)逡逑尺見右下角）逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2606210