人小涎腺間充質(zhì)干細胞體外快速成肝誘導相關(guān)研究

發(fā)布時間：2020-03-29 16:14

【摘要】：研究背景及意義成體干細胞源肝細胞為肝病的治療提供了新思路,其中種子細胞的獲得和肝功能重塑是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對于不同成體干細胞成功誘導功能性肝細胞的報道很多,但誘導的低效性大大限制了其臨床應用。小涎腺同屬消化道腺體,具有來源廣泛,取材方便與供區(qū)損傷小的優(yōu)點,是非常理想的成體干細胞來源,具有巨大的研究價值和應用潛力。此外,我課題組進行人小涎腺干細胞研究時發(fā)現(xiàn),人小涎腺間充質(zhì)干細胞(hMSG-MSCs)表達較多肝細胞相關(guān)蛋白,提示hMSG-MSCs可能成為體外快速獲得功能性肝細胞的種子細胞。利用人小涎腺間充質(zhì)干細胞進行快速體外成肝誘導,將為肝病細胞治療提供理論基礎和技術(shù)支持。目的1.從人小涎腺組織分離獲得間充質(zhì)干細胞,對hMSG-MSCs進行鑒定,為體外快速成肝誘導做干細胞源基礎。2.對hMSG-MSCs進行快速體外成肝誘導,并鑒定誘導細胞相關(guān)基因和蛋白表型,檢測最終誘導獲得細胞是否具有成熟肝臟細胞相關(guān)功能。方法1.對人小涎腺組織進行原代培養(yǎng),從中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞,體外傳代擴增。利用流式細胞儀對獲得細胞進行表型鑒定,并進行成骨成脂分化誘導。2.在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下,通過三步法利用CHIR99021、HGF、FGF4、EGF等細胞誘導因子對hMSG-MSCs進行快速成肝誘導,觀察誘導過程中細胞狀態(tài)及形態(tài)變化,利用Real-time PCR及免疫熒光檢測誘導細胞相關(guān)表型的表達,并通過PAS染色和ICG攝取檢測最終誘導獲得細胞相關(guān)成熟肝臟細胞功能。結(jié)果1.從人小涎腺組織塊中成功分離培養(yǎng)獲得hMSG-MSCs,該細胞呈紡錘樣(長梭形),體外增殖迅速,且其細胞特性保存完整。細胞流式分析表明,獲得的hMSG-MSCs表達CD29、CD90和CD166等間充質(zhì)干細胞標記物,不表達CD117、CD45等造血干細胞標記,也不表達CD49f等上皮類細胞標記,并且可成功向骨、脂肪方向進行分化。2.在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下,三步法hMSG-MSCs體外成肝誘導共用時6天。誘導第一天后,80%-90%的細胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎趟笮?第二天后細胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切?第六天后最終變?yōu)轭惛渭毎螒B(tài)。Real-time PCR顯示,內(nèi)胚系祖細胞標志物F0XA2、S0X17及新生肝細胞標志物AFP先升高后降低,成熟肝細胞標志物ALB、CYP3A4和AAT持續(xù)升高。免疫熒光檢測不同階段相關(guān)蛋白陽性表達。ICG攝取和PAS染色均為陽性。結(jié)論1.由人小涎腺組織可分離培養(yǎng)獲得hMSG-MSCs,該細胞具有強大自我更新能力和多向分化潛能,可以作為體外快速成肝誘導的種子細胞。2..hMSG-MSCs在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下通過三步法6天成肝誘導,最終所獲得的細胞為成熟且具有一定功能的肝細胞。
【圖文】：

小涎腺,位論,協(xié)和,整形外科

圖１－１邋ｈＭＳＧ－ＭＳＣｓ原代及傳代培養(yǎng)逡逑ａ．人小涎腺組織大體觀察；ｈ－ｃ．小涎腺纟ｊＬ織股代培養(yǎng)（ｂ．邋４０Ｘ，ｃ．邋１００Ｘ）；逡逑ｄ－ｅ．邋ｈＭＳＧ－ＭＳＣｓ傳至Ｐ３可獲得形態(tài)均－？的長梭形細胞（ｄ．邋４０Ｘ，，邋ｅ．邋２００Ｘ），體外十．長逡逑以好，增殖迅速

鑒定結(jié)果,潛能,實驗組