【摘要】：生物活性肽是具有調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動(dòng)和某種生理活性功能的肽的總稱(chēng)。蛋白肽易吸收、生物活性強(qiáng)、安全性高、無(wú)毒副作用,具有特殊的氨基酸組成,已被證實(shí)其具有抗腫瘤、抗氧化、抗高血壓、降膽固醇等功效。已有研究發(fā)現(xiàn),綠豆肽具有免疫調(diào)節(jié)作用,但對(duì)于綠豆肽在先天免疫方面是如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制還不甚清楚。本研究以綠豆肽(Mw1000 Da,含量96%)為原料,以機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞為模型,結(jié)合色譜技術(shù)、光譜技術(shù),研究綠豆肽結(jié)構(gòu)與其免疫活性的關(guān)系,找出具備較高免疫活性的綠豆肽分子量、氨基酸序列及關(guān)鍵組分;進(jìn)而研究綠豆肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子以及相關(guān)信號(hào)通路基因的表達(dá),找出綠豆肽具有免疫活性的關(guān)鍵因子;建立環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠模型,探討綠豆肽對(duì)免疫低下小鼠天然免疫活性以及相關(guān)免疫信號(hào)通路,以揭示綠豆肽激活巨噬細(xì)胞,發(fā)揮非特異免疫的作用機(jī)制,從機(jī)理角度闡明綠豆肽的高免疫活性。1.利用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù),從體外水平研究不同劑量的綠豆肽對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞影響,以探討綠豆肽的免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果得出,綠豆肽呈劑量依賴(lài)性提高細(xì)胞增殖率、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活力、一氧化氮含量(Nitric oxide,NO)以及細(xì)胞因子分泌量,還可顯著抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)細(xì)胞的腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-6分泌量。且綠豆肽能降低LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 Light chain 3,LC3)的含量,并促進(jìn)LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化,下調(diào)LC3II/LC3I蛋白的表達(dá)量,上調(diào)胞內(nèi)p62蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明,綠豆肽具有較強(qiáng)的免疫活性,且免疫活性的發(fā)揮與綠豆肽促進(jìn)免疫活性物質(zhì)分泌、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌以及抑制細(xì)胞自噬等多種因素有關(guān)。2.采用SephadexG-15層析法分離得到三個(gè)不同級(jí)分的綠豆肽,采用色譜技術(shù)、氨基酸分析技術(shù)以及光譜技術(shù),結(jié)合免疫活性測(cè)定得出:綠豆肽的第三級(jí)分(P3峰)的免疫活性最強(qiáng),疏水性也較強(qiáng),巨噬細(xì)胞糖原、核酸代謝活性顯著增加,IL-1β、IL-6和IL-10的水平提升。采用液質(zhì)聯(lián)用裝置對(duì)分離后得到的P3進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,得出P3的主要氨基酸序列分別為Phe-Leu-Val-Asn-Arg-Ile(885.1 Da),Phe-Leu-Val-Asn-Pro-Asp-Asp,(961.06Da),Lys-Asp-Asn-Val-Ile-Ser-Glu-Leu(1043.13 Da)。FTIR光譜分析結(jié)果得出綠豆肽在α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加時(shí)免疫活性增強(qiáng)。3.采用PCR技術(shù)分析不同處理組的TLR1、TLR2和TLR4受體mRNA表達(dá)量水平,結(jié)果表明LPS組的TLR1、TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)量顯著提高(p0.05),綠豆肽組對(duì)巨噬細(xì)胞TLR1和TLR4受體表達(dá)量有一定影響,但對(duì)TLR2受體無(wú)明顯影響;綠豆肽能顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的TLR1、TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)量。采用anti-TLR1和anti-TLR4抗體對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理,測(cè)定綠豆肽對(duì)阻斷TLR受體的處理組的細(xì)胞因子表達(dá)水平,結(jié)果表明anti-TLR1和anti-TLR4處理組的IL-6、IL-1β和TNF-α的細(xì)胞因子分泌水平顯著低于MBPs組,且TLR1阻斷組的細(xì)胞因子分泌水平顯著被抑制,抑制水平達(dá)到50%以上,這些研究結(jié)果推斷出TLR1是綠豆肽激活巨噬細(xì)胞的主要受體。4.采用western blotting方法對(duì)MAPK的三個(gè)主要亞基p38,ERK1/2和JNK以及其磷酸化表達(dá)水平和NF-κB通路的相關(guān)蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果為綠豆肽對(duì)巨噬細(xì)胞MAPK通路的三個(gè)主要亞基p38、ERK1/2和JNKLPS的表達(dá)量有顯著影響。采用MAPK信號(hào)通路的P38抑制劑(SB203580)、ERK抑制劑(PD98059)、JNK抑制劑(SP600125)處理巨噬細(xì)胞,分別測(cè)定綠豆肽對(duì)巨噬細(xì)胞的TNF-α和IL-6分泌量,結(jié)果得出p38和ERK1/2抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6的分泌量影響較大,表明綠豆肽激活細(xì)胞因子的表達(dá)依賴(lài)于MAPK相關(guān)的信號(hào)通路,且p38和ERK對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌起主要作用。LPS處理組的細(xì)胞核內(nèi)p65和細(xì)胞質(zhì)中IκBα的相對(duì)蛋白表達(dá)水平顯著升高,而采用不同濃度綠豆肽處理LPS誘導(dǎo)組的細(xì)胞核內(nèi)p65和細(xì)胞質(zhì)中IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性降低;綠豆肽可以激活NF-κB的核移位,但其入核程度顯著低于LPS。采用NF-κB通路的特定抑制劑處理巨噬細(xì)胞得出,綠豆肽處理組的TNF-α和IL-6的分泌量較正常組小,這表明綠豆肽激活細(xì)胞因子的表達(dá)依賴(lài)于MAPK和NF-κB通路。5.采用ELISA、PCR和western blotting技術(shù)分析綠豆肽對(duì)BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫活性以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究,結(jié)果得出綠豆肽組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的TNF-α分泌量顯著增加,而經(jīng)TLR1阻斷劑處理后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的TNF-α分泌量較未處理組顯著降低,且不同濃度綠豆肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的TNF-α分泌量影響無(wú)差異。不同濃度綠豆肽可顯著增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的IL-6分泌量;而TLR1阻斷劑處理后各組的IL-6分泌量顯著低于綠豆肽組。綠豆肽可以通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK和NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)綠豆肽誘導(dǎo)TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,證明綠豆肽是通過(guò)MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞。6.綠豆肽可改善環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的脾臟狀態(tài),增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力,提高TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的分泌,且綠豆肽可顯著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的MAPK和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá),證實(shí)綠豆肽是經(jīng)由MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活巨噬細(xì)胞,發(fā)揮先天免疫作用。在此基礎(chǔ)上對(duì)免疫低下小鼠進(jìn)行熱應(yīng)激處理,結(jié)果表明綠豆肽能很好的改善免疫低下小鼠血清的皮質(zhì)醇和葡萄糖濃度,以及SOD和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,GOT)活性,這也說(shuō)明綠豆肽可提高免疫低下小鼠的機(jī)體活力,即提高了免疫低下小鼠的免疫能力。綜合以上結(jié)果,綠豆肽可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮免疫活性,且免疫活性與其分子量大小、氨基酸含量、疏水性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān);綠豆肽能夠上調(diào)機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),這一過(guò)程可能是通過(guò)TLR1受體調(diào)控p38、ERK1/2和NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2606140