【摘要】：背景α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)陽(yáng)性包涵體在神經(jīng)系統(tǒng)形成及播散是α-突觸核蛋白病共同的核心病理特征~([1])。α-Syn陽(yáng)性包涵體選擇性累及神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域?qū)е虏煌膊“Y候群~([2])。多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy,MSA)是一種散發(fā)的進(jìn)展迅速、預(yù)后差的α-突觸核蛋白病,神經(jīng)系統(tǒng)多部位受累,缺乏有效治療辦法。其臨床表現(xiàn)為自主神經(jīng)功能障礙、左旋多巴非敏感性帕金森癥狀、小腦性共濟(jì)失調(diào),或三種癥狀共存。以泌尿生殖功能障礙為主的自主神經(jīng)障礙是其主要臨床表現(xiàn)~([3])。建立MSA的動(dòng)物模型可以重現(xiàn)MSA的各種臨床癥狀及病理特點(diǎn),為研究MSA的發(fā)病機(jī)制、探索MSA的診斷及治療提供更好的平臺(tái)。目前MSA動(dòng)物模型的研究限于神經(jīng)毒物或轉(zhuǎn)基因模型,僅展現(xiàn)MSA部分病理改變及運(yùn)動(dòng)癥狀,未能很好的模擬MSA的自主神經(jīng)功能障礙~([4-6])。本研究構(gòu)建α-Syn陽(yáng)性包涵體從尿道外括約肌(external urethral sphincter,EUS)神經(jīng)末梢沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的小鼠模型,模擬MSA的病理改變,進(jìn)一步誘導(dǎo)MSA類(lèi)似的自主神經(jīng)功能障礙及運(yùn)動(dòng)障礙。此結(jié)果提示:α-Syn陽(yáng)性包涵體沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至CNS可能導(dǎo)致MSA癥候群。多系統(tǒng)萎縮是一種致命的多系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病,其特征在于快速進(jìn)展性自主神經(jīng)衰竭,小腦性共濟(jì)失調(diào)和帕金森樣癥狀的可變組合~([7])。目前公認(rèn)的MSA的病理學(xué)特征是在少突膠質(zhì)細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的α-Syn聚集形成的包涵體(glial cytoplasmic inclusions,GCIs),以及神經(jīng)細(xì)胞α-Syn包涵體(neuronal inclusions,NIs)~([8])。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,將MSA病人的腦勻漿注射于TgM83轉(zhuǎn)基因小鼠腦部后,可以誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)MSA類(lèi)似的病理改變及運(yùn)動(dòng)功能障礙,揭示了α-Syn播散理論在MSA等α-突觸核蛋白病中的作用機(jī)制~([9])。然而,錯(cuò)誤折疊的α-Syn播散的起源和及播散途徑尚未得到研究闡明。根據(jù)最新的指南,泌尿生殖系統(tǒng)功能障礙,直立性低血壓和等自主神經(jīng)功能障礙是診斷MSA所必需的癥狀�；仡櫺詳�(shù)據(jù)表明,大多數(shù)MSA患者在出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙幾年前便可出現(xiàn)自主神經(jīng)癥狀,其中以泌尿系統(tǒng)癥狀多見(jiàn)。此外,錐體外系癥狀患者的泌尿生殖功能障礙被認(rèn)為有助于區(qū)分早期疾病階段的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和MSA~([10])。神經(jīng)病理學(xué)研究表明,MSA患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,排尿反射通路存在廣泛的退行性改變及α-Syn沉積,包括導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(periaqueductal gray,PAG),藍(lán)斑(locus caeruleus,LC),巴靈頓核(Barrington’s nucleus,BN),中間外側(cè)柱(intermediolateral columns,IML),脊髓Onuf’s核等核團(tuán)~([11,12]),這可能是導(dǎo)致MSA患者早期出現(xiàn)泌尿生殖功能障礙的原因。迄今為止,MSA等α-突觸核蛋白病的發(fā)病機(jī)制仍不明確,研究者構(gòu)建了各種動(dòng)物模型以探索其發(fā)病機(jī)制和尋找治療手段,然而這些動(dòng)物模型均局限于系統(tǒng)毒物模型或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,雖然部分展示了α-突觸核蛋白病的神經(jīng)病理改變及相關(guān)運(yùn)動(dòng)障礙,但這些模型均不能模擬α-突觸核蛋白病的完整發(fā)病過(guò)程,且?guī)缀鯖](méi)有動(dòng)物模型模擬MSA類(lèi)似的自主神經(jīng)功能障礙~([4])。因此,構(gòu)建α-突觸核蛋白病的動(dòng)物模型需要新的策略。在這里,我們用轉(zhuǎn)基因小鼠模型來(lái)研究MSA的起源和發(fā)病機(jī)制。我們將預(yù)先制備的α-Syn纖維體(preformedα-syn fibrils,α-Syn PFFs)注射于TgM83~(+/-)小鼠的尿道外括約肌,誘導(dǎo)α-Syn陽(yáng)性包涵體沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至CNS,并模擬MSA類(lèi)似的運(yùn)動(dòng)及排尿障礙。本研究提出:“α-Syn陽(yáng)性包涵體從EUS神經(jīng)纖維末梢沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至大腦導(dǎo)致MSA癥候群”的新假說(shuō),為揭示MSA的病理機(jī)制,尋找阻止MSA的病程進(jìn)展的特異性分子靶標(biāo)建立更為優(yōu)化的動(dòng)物模型。目的本研究擬通過(guò)構(gòu)建α-Syn陽(yáng)性包涵體沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散的MSA小鼠模型,模擬MSA類(lèi)似的自主神經(jīng)功能障礙及運(yùn)動(dòng)障礙,進(jìn)一步探討α-Syn播散在α-突觸核蛋白病中的作用機(jī)制。方法1.制備并檢測(cè)α-Syn纖維體。2.將8周齡TgM83雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組,分別在其EUS注射α-Syn PFFs和磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)。3.于注射前及注射后每2周進(jìn)行小鼠尿動(dòng)力檢測(cè)、肛周肌電圖和行為學(xué)評(píng)價(jià),并于注射后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、6個(gè)月、7個(gè)月、8個(gè)月、9個(gè)月、10個(gè)月處死實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠各6只,灌注后取材備用。4.分別對(duì)上述造模后時(shí)間點(diǎn)的小鼠尿道外括約肌、盆神經(jīng)節(jié)、泌尿相關(guān)核團(tuán)所在的脊髓、腦層面(Onuf’s核,IML,LC,BN,PAG等)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry,IHC)、免疫熒光雙標(biāo)染色(double immunofluorescence)及蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western blot,WB),觀察α-Syn陽(yáng)性包涵體在造模后小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的形成及播散情況。5.進(jìn)行尿動(dòng)力、肛周肌電圖、行為學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.α-Syn纖維體注射轉(zhuǎn)基因小鼠尿道外括約肌后形成α-Syn陽(yáng)性包涵體。2.誘導(dǎo)α-Syn陽(yáng)性包涵體沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散至CNS,于泌尿相關(guān)核團(tuán)形成α-Syn包涵體,模擬MSA類(lèi)似的病理改變。3.誘導(dǎo)造模后實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)MSA類(lèi)似的泌尿障礙及肛周肌電圖失神經(jīng)改變。4.誘導(dǎo)造模后實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)MSA類(lèi)似的運(yùn)動(dòng)功能障礙。結(jié)論1.α-Syn纖維體外周注射能在TgM83轉(zhuǎn)基因小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成陽(yáng)性包涵體。2.α-Syn陽(yáng)性包涵體可以從尿道外括約肌神經(jīng)末梢沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路(EUS,Onuf’s核,IML,LC,BN,PAG等)逆行播散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。3.α-Syn陽(yáng)性包涵體沿泌尿生殖相關(guān)自主神經(jīng)通路逆行播散小鼠模型可模擬MSA的病理改變,自主神經(jīng)功能障礙及運(yùn)動(dòng)障礙。
【圖文】：
圖 1 電鏡下展示 α-Syn 纖維體的圓筒狀纖維細(xì)絲形態(tài)（比例尺：200nm）3.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠泌尿通路 α-Syn 陽(yáng)性包涵體表達(dá)造模后 2 個(gè)月內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均無(wú)異常病理表現(xiàn)。造模后 3 個(gè)月，，實(shí)驗(yàn)組小鼠尿道外括約肌、盆神經(jīng)節(jié)、泌尿相關(guān)核團(tuán)（脊髓、小腦、腦橋、中腦等）可檢測(cè)到 α-突觸核蛋白陽(yáng)性包涵體沉積，呈棕褐色顆粒狀、斑塊狀。而對(duì)照組小鼠一直到造模后 12 個(gè)月仍未檢測(cè)到相應(yīng)病理改變（圖 2, 3）。
圖 2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠 EUS、盆神經(jīng)節(jié) α-Syn 陽(yáng)性包涵體的表達(dá)。A1, 2：實(shí)驗(yàn)組小鼠 EUS；A3：對(duì)照組小鼠 EUS；B1-4：實(shí)驗(yàn)組小鼠盆神經(jīng)節(jié)。（A1-3 左 x 10；A1-3 右x 40；B1-4 左 x 20；B1-4 右 x 40）圖 3 免疫組織化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓中間外側(cè)柱，腦橋?qū)用婷谀蛳嚓P(guān)核團(tuán)（藍(lán)斑、
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R742;R-332
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4 楊海O
本文編號(hào)：2604740
