【摘要】：MicroRNA(miRNA)作為內(nèi)源性非編碼RNA,幾乎參與真核生物細(xì)胞發(fā)育的所有過程。臨床上過敏性皮炎、牛皮蘚和銀屑病等皮膚疾病引起了長時(shí)間的瘙癢,不僅嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,還帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了探討不同的瘙癢癥及其發(fā)病機(jī)制,近年來建立了各種慢性癢的動物模型,如丙酮/乙醚/水(acetone/ether/water,AEW)誘導(dǎo)的皮膚干燥模型和2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)誘導(dǎo)的過敏性皮炎模型。已有研究表明慢性癢通常伴隨著皮膚損傷,進(jìn)而使得癢覺受體出現(xiàn)持續(xù)活化,從而引起神經(jīng)元敏化,影響炎癥因子的釋放,而炎癥因子會受到miRNA的調(diào)控,因此我們推測miRNA可能參與了慢性癢信號的調(diào)控。為了研究miRNA與慢性癢形成的關(guān)系,本論文利用AEW誘導(dǎo)的皮膚干燥和DNFB誘導(dǎo)的過敏性皮炎兩種不同的慢性癢模型系統(tǒng)評價(jià)了慢性癢、miRNA和炎癥因子之間的關(guān)系,并進(jìn)一步在體外評價(jià)其功能性聯(lián)系。在小鼠上建立AEW誘導(dǎo)的皮膚干燥和DNFB誘導(dǎo)的過敏性皮炎兩種慢性癢模型,行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)AEW或DNFB處理后顯著增加了小鼠頸背部的抓撓次數(shù)。進(jìn)一步,從兩種慢性癢模型小鼠中分別取出脊髓和頸背部的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)組織,以用于檢測這些組織中23種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的miRNA和9種常見的炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明:(1)AEW處理后顯著上調(diào)了小鼠的脊髓中miR-124-3p和miR-142a-3p的表達(dá);(2)AEW處理后顯著下調(diào)了小鼠DRG組織中miR-124-3p和miR-142a-3p的表達(dá);(3)DNFB處理后下調(diào)了小鼠DRG組織中miR-142a-3p的表達(dá)。以上結(jié)果說明慢性癢形成后顯著影響了miR-142a-3p的表達(dá)。此外,對炎癥因子的檢測發(fā)現(xiàn):(1)AEW處理后顯著影響了IL-6、IL-17、IL-10、TNF-α以及CCL2的表達(dá),其中DRG組織中IL-6表達(dá)上調(diào)至296%;(2)DNFB處理后顯著影響了IL-6、IL-13和CCL3的表達(dá),其中IL-6的表達(dá)在脊髓中上調(diào)至338%,在DRG中上調(diào)至630%。說明AEW或DNFB處理后顯著上調(diào)了IL-6的表達(dá)。綜上所述,在慢性癢模型DRG組織中miR-142a-3p與IL-6的表達(dá)水平變化最為明顯,并且二者呈負(fù)相關(guān)。上述的研究結(jié)果提示著miR-142a-3p和IL-6之間可能存在潛在的功能性聯(lián)系。為了進(jìn)一步研究miR-142a-3p和IL-6之間是否存在相互作用,本論文利用小膠質(zhì)細(xì)胞瘤BV-2細(xì)胞系,對這二者之間的相互作用進(jìn)行了體外研究和驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示:在經(jīng)典致炎物質(zhì)脂多糖(LPS)的誘導(dǎo)下,BV-2細(xì)胞中miR-142a-3p的表達(dá)水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的下調(diào)(0-8 h),而IL-6的表達(dá)水平卻呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的上調(diào)(0-8h)。通過向BV-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA模擬物(agomir-miR-142a-3p)構(gòu)建了miR-142a-3p的超表達(dá)細(xì)胞。在miR-142a-3p的超表達(dá)細(xì)胞中,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測發(fā)現(xiàn)IL-6表達(dá)量在LPS誘導(dǎo)后出現(xiàn)了顯著的下調(diào),從而說明miR-142a-3p可能會調(diào)控IL-6的表達(dá)。隨后對miR-142a-3p進(jìn)行了靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)IL-6是miR-142a-3p潛在靶標(biāo)之一,并用RNA hybrid軟件進(jìn)行了雙鏈自由能分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者極有可能發(fā)生相互作用。因此,體外功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-142a-3p可能會直接靶向IL-6基因,影響其表達(dá)。綜上所述,本研究表明:在慢性癢模型小鼠的DRG組織中miR-142a-3p的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,而IL-6的表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著的上調(diào),進(jìn)一步的體外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-142a-3p能直接調(diào)控IL-6的表達(dá)。因此,我們推測miR-142a-3p可能通過直接作用于IL-6的mRNA,從而間接參與了慢性癢的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。該研究有助于揭示慢性癢的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制,從而為慢性癢的治療提供理論依據(jù)。
【圖文】：

3.1 AEW 慢性癢模型小鼠頸胸段脊髓和 DRG 中 miRNA 和炎癥因子的表達(dá)3.1.1 AEW 慢性癢模型及其行為學(xué)研究正常昆明系小鼠頸背部脫毛后，用乙醚和丙酮混合液連續(xù)處理 12 天，每天上午和下午定時(shí)處理一次，建立 AEW 皮膚干燥慢性癢模型，對照組按同樣的方式用去離子水處理。在第 8 天、第 10 天和第 12 天，觀察小鼠頸背部皮膚變化情況，發(fā)現(xiàn) AEW 組小鼠頸背部皮膚表面有白色的皮屑，并伴有干裂現(xiàn)象；而對照組經(jīng)去離子水處理后，其頸背部皮膚表面無明顯的白色皮屑和干裂，表明對照組小鼠未出現(xiàn)皮膚干燥現(xiàn)象。為了評價(jià) AEW 皮膚干燥慢性癢模型對小鼠癢覺行為的影響，分別在處理第 8 天、第 10 天和第 12 天進(jìn)行行為檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示，與對照組相比，AEW 組在第 8 天、第 10 天和第 12 天的抓撓次數(shù)出現(xiàn)顯著增加（均值分別是 70、72 和 86，P ＜ 0.001），，說明 AEW 慢性癢小鼠模型建模成功。

29圖 3-2 AEW誘導(dǎo)的干燥皮膚模型脊髓和 DRG中 miRNA的相對表達(dá)量 脊髓和DRG 中對照組（CON）和實(shí)驗(yàn)組（AEW）樣品數(shù)為 5. 數(shù)據(jù)用均值 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。*P < 0.05、**P < 0.01和***P < 0.001 表示實(shí)驗(yàn)組與其相應(yīng)的對照組比較后組間差距顯著，采用 t 檢驗(yàn)進(jìn)行檢測。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R-332;R758.31

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本文編號：2603927