【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是臨床上最主要的超級細菌種類之一,對常用抗生素都表現(xiàn)出很強的耐藥性,且其能夠通過多種機制獲得耐藥性,例如形成生物膜之后抗生素難以進入生物膜,使得耐藥性增強,或通過III型分泌系統(tǒng)侵入細胞成為胞內(nèi)菌,抗生素難以進入細胞從而難以被殺滅。鑒于銅綠假單胞菌在抗生素治療中存在的固有耐藥,以及形成生物膜與胞內(nèi)菌后使得耐藥性增強等原因,傳統(tǒng)的抗生素治療越來越難以控制銅綠假單胞菌感染,因此亟需開發(fā)新型的治療方式。抗體藥物具有特異性強、安全性高等特性,在抗細菌感染方面具有獨特優(yōu)勢,因此近年來開始獲得重視。本研究通過選取銅綠假單胞菌PcrV與Alginate兩個靶點,制備單鏈可變區(qū)融合重鏈恒定區(qū)(ScFv-Fc)形式的抗體MFa(抗PcrV)與MFb(抗Alginate),并分析其親和活性,進而研究其體外對銅綠假單胞菌生物膜形成、黏附細胞、侵入細胞的影響,為進一步開發(fā)抗銅綠假單胞菌感染的新型抗體藥物提供研究基礎(chǔ)。本研究首先將編碼MFa及MFb的DNA序列分別合成后,插入到真核表達載體中,獲得重組質(zhì)粒,再通過聚乙烯亞胺(PEI)在HEK293E細胞中獲得瞬時轉(zhuǎn)染及表達;表達的產(chǎn)物通過HiTrap MabSelect SuRe柱進行純化,所得到的抗體通過SDS-PAGE分析純度以及BCA法測定蛋白含量。為了研究抗體與抗原的親和活性,對抗原PcrV與Alginate進行制備。其中PcrV抗原選用pET28a質(zhì)粒作為載體,將PcrV目的序列插入到pET28a中構(gòu)建重組質(zhì)粒,進而轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中,在15℃,0.5 mM IPTG的條件下進行低溫誘導(dǎo)表達,通過與PcrV融合表達的His-Tag標(biāo)簽進行親和純化,并通過SDS-PAGE、BCA、HPLC對純化的PcrV進行純度及含量的分析;Alginate通過EDC作用與BSA進行偶聯(lián)以開發(fā)針對MFb的Western blot及ELISA等檢測方法。對純化后的抗體通過Western blot、ELISA、表面等離子共振(SPR)檢測其與抗原的親和活性。我們進一步對所制備的抗體MFa及MFb進行體外對銅綠假單胞菌的活性研究,主要分以下幾個方面:MFa及MFb抗體對生物膜形成的影響、對已形成的生物膜的破壞作用、對銅綠假單胞菌黏附HeLa細胞影響、對銅綠假單胞菌侵入HeLa細胞的影響,以及對巨噬細胞吞噬銅綠假單胞菌的影響。本研究獲得以下結(jié)果:一、成功制備了抗銅綠假單胞菌PcrV與Alginate的抗體MFa及MFb。親和力實驗表明,MFa與PcrV抗原的親和常數(shù)K_D為492.2 nM,MFb與Alginate抗原的親和常數(shù)K_D為8.308 nM。二、抗體的體外生物學(xué)活性表明MFa與MFb均能夠降低銅綠假單胞菌生物膜的形成,降低銅綠假單胞菌對HeLa細胞的黏附作用,并能夠降低銅綠假單胞菌對HeLa細胞的侵入作用,同時MFa與MFb單獨使用均能夠增加巨噬細胞對銅綠假單胞菌的吞噬作用。綜上,本研究制備了靶向銅綠假單胞菌的scFv-Fv形式的抗體藥物分子MFa及MFb,它們分別靶向PcrV蛋白及Alginate,體外生物學(xué)活性分析表明兩個抗體均能夠在一定程度上作用于生物膜形成,降低胞內(nèi)寄生菌的形成,增強巨噬細胞的吞噬作用,提示其具有對銅綠假單胞菌引起的感染的潛在效用,具有進一步開發(fā)為抗銅綠假單胞菌治療藥物的價值。
【圖文】：

銅綠假單胞菌生物膜[25]

3圖 1-2. 銅綠假單胞菌侵入細胞[31]Fig. 1-2. Pseudomonas aeruginosa invade mammal cells[31]
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 毛磊;王煒;蘇建榮;;北京市某醫(yī)院354株銅綠假單胞菌分布及耐藥情況分析[J];檢驗醫(yī)學(xué);2019年06期

2 毛劍鋒;王偉;徐偉珍;李彩霞;;銅綠假單胞菌耐消毒劑-磺胺基因及β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因研究[J];浙江檢驗醫(yī)學(xué);2007年01期

3 陳其云;余志平;;47株銅綠假單胞菌的藥敏試驗[J];水電醫(yī)學(xué)雜志;2000年04期

4 唐鳳強;孟紅;張力;張秋紅;趙銳;;銅綠假單胞菌醫(yī)院感染分布及耐藥性分析[J];中國水電醫(yī)學(xué);2008年06期

5 鄭計梅;;銅綠假單胞菌在水體的生長特性研究及其在不同溫度下生長預(yù)測模型的建立[J];廣東化工;2018年22期

6 林麗容;;銅綠假單胞菌分布及耐藥情況分析[J];臨床合理用藥雜志;2018年35期

7 吳廣江;薛文英;馬穎欣;陳亮;肖敏;;某院銅綠假單胞菌獲得性肺炎病原菌分析及院感防控[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2019年05期

8 沈先軍;張鳳嬌;常桂玲;曹琳;;銅綠假單胞菌致一起“假暴發(fā)、真聚集”疫情的調(diào)查報告[J];中國老年保健醫(yī)學(xué);2017年06期

9 王靜;陳葳;曾曉艷;張yN;雷金娥;;不同標(biāo)本來源銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺酶耐藥表型的差異性分析[J];現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2017年03期

10 謝志碰;葉招興;;815例銅綠假單胞菌分布及藥敏分析[J];按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué);2018年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張曉燕;楊鳳琴;張麗平;;98株銅綠假單胞菌的分布及藥敏結(jié)果分析[A];首屆中國臨床微生物學(xué)大會（寧波會議）暨《醫(yī)學(xué)參考報》微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2010年

2 周明明;周鐵麗;李超;吳慶;陳櫟江;吳蓮鳳;彭定輝;;主動外排在銅綠假單胞菌耐藥中的作用研究[A];2009年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

3 丁艷苓;陳亞紅;姚婉貞;寧永忠;;2007年-2009年銅綠假單胞菌的耐藥性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會第七屆全國呼吸道感染學(xué)術(shù)大會暨第一屆多學(xué)科抗感染治療學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

4 方莉;許媛;黃義山;蔡燕;唐中;楊明輝;廖濤;;銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

5 李琬琛;魏殿軍;李立艷;曹陽;宋林;劉雙慶;;五種抗生素對銅綠假單胞菌生物膜抑制、清除作用及作用機制的探討[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國中青年檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

6 馬春燕;賈海菊;;對本院116株銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果的回顧性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會2014全國微生物學(xué)與免疫學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2014年

7 朱丹;李欣;;對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌的體外藥敏分析[A];2005年浙江省呼吸系病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

8 洪波;貢聯(lián)兵;;銅綠假單胞菌對亞胺培南的藥敏分析[A];第五次全國中青年檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 趙書平;姜梅杰;;神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護室銅綠假單胞菌氨基糖苷類修飾酶基因研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2008年

10 王艷艷;安樂;唐克;張曉天;王秀麗;劉月;李明成;;銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的研究進展[A];首屆中國臨床微生物學(xué)大會（寧波會議）暨《醫(yī)學(xué)參考報》微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者 洪敬譜;飲用水中的致病菌從哪來[N];中國消費者報;2017年

2 李曙平;銅綠假單胞菌 老年病房的主要致病菌[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 俞云松;銅綠假單胞菌耐藥全國流行[N];健康報;2008年

4 山東省濰坊市食品藥品監(jiān)管局 羅秋;包裝飲用水中銅綠假單胞菌超標(biāo)如何定性處理[N];中國醫(yī)藥報;2018年

5 科信食品與營養(yǎng)信息交流中心;飲用水中銅綠假單胞菌超標(biāo)還能放心喝嗎？[N];中國食品安全報;2016年

6 記者 劉文新;貴州 3批次飲用水檢出銅綠假單胞菌[N];中國消費者報;2019年

7 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗科 胡志東;關(guān)注銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥[N];健康報;2009年

8 王振嶺;銅綠假單胞菌耐藥問題嚴(yán)重[N];中國醫(yī)藥報;2002年

9 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 丁雪霏 戴浩然 柴瑞靄 郭玉紅;從補腎填精論治銅綠假單胞菌泌尿感染[N];中國中醫(yī)藥報;2016年

10 ;碳青霉烯類抗生素[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李永偉;EMMPRIN對宿主感染銅綠假單胞菌抵抗力的作用機制研究[D];武漢大學(xué);2017年

2 楊帥;銅綠假單胞菌粘附表型及其差異的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2018年

3 王可;銅綠假單胞菌在持續(xù)感染中的基因型特征及在呼吸機相關(guān)性肺炎中演化的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

4 劉偉明;整合素αvβ6在銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細胞EMT中的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

5 魏殿軍;臨床分離菌株耐藥性分析及銅綠假單胞菌耐藥機制的探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

6 趙燕;銅綠假單胞菌對氨基糖苷類及碳青霉烯類抗生素的耐藥性及相關(guān)耐藥基因的研究[D];四川大學(xué);2004年

7 程仕虎;氨基糖苷類藥物對銅綠假單胞菌耐藥突變選擇窗的實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2007年

8 衣美英;外科監(jiān)護室銅綠假單胞菌多重耐藥機制研究[D];華中科技大學(xué);2006年

9 吳迪;耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的分子流行病學(xué)研究[D];華中科技大學(xué);2006年

10 徐衛(wèi)華;微生物還原Cr（Ⅵ）的特性與機理研究[D];湖南大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊倩;亞甲藍介導(dǎo)的光動力療法對銅綠假單胞菌的體外殺傷作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

2 卿草;單純銅綠假單胞菌、白色念珠菌及兩者共同感染呼吸機相關(guān)性肺炎的臨床特征比較[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

3 孫倩楠;新疆地區(qū)銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力基因研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2019年

4 翟貫星;靶向銅綠假單胞菌PcrV與Alginate的scFv-Fc抗體分子制備及體外活性研究[D];上海師范大學(xué);2019年

5 湯湘;銅綠假單胞菌表面展示CadR蛋白并應(yīng)用于水體及土壤的研究[D];湖南大學(xué);2018年

6 王荔月;銅綠假單胞菌PAO1基因PA0335的功能研究[D];西北大學(xué);2018年

7 喬琦;銅綠假單胞菌NY3胞外活性物降解多環(huán)芳烴的特性及機理研究[D];西安建筑科技大學(xué);2018年

8 朱迎曉;銅綠假單胞菌中c-di-GMP調(diào)控MapZ與CheR1相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)研究[D];山東大學(xué);2018年

9 秦婧;銅綠假單胞菌P型ATP酶PA1429調(diào)控喹諾酮信號系統(tǒng)和細菌毒性的研究[D];西北大學(xué);2018年

10 宋雅琴;銅綠假單胞菌中CysB的結(jié)構(gòu)及其調(diào)節(jié)機制的研究[D];西北大學(xué);2018年

，

本文編號：2601039