【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是臨床上最主要的超級(jí)細(xì)菌種類(lèi)之一,對(duì)常用抗生素都表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性,且其能夠通過(guò)多種機(jī)制獲得耐藥性,例如形成生物膜之后抗生素難以進(jìn)入生物膜,使得耐藥性增強(qiáng),或通過(guò)III型分泌系統(tǒng)侵入細(xì)胞成為胞內(nèi)菌,抗生素難以進(jìn)入細(xì)胞從而難以被殺滅。鑒于銅綠假單胞菌在抗生素治療中存在的固有耐藥,以及形成生物膜與胞內(nèi)菌后使得耐藥性增強(qiáng)等原因,傳統(tǒng)的抗生素治療越來(lái)越難以控制銅綠假單胞菌感染,因此亟需開(kāi)發(fā)新型的治療方式。抗體藥物具有特異性強(qiáng)、安全性高等特性,在抗細(xì)菌感染方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),因此近年來(lái)開(kāi)始獲得重視。本研究通過(guò)選取銅綠假單胞菌PcrV與Alginate兩個(gè)靶點(diǎn),制備單鏈可變區(qū)融合重鏈恒定區(qū)(ScFv-Fc)形式的抗體MFa(抗PcrV)與MFb(抗Alginate),并分析其親和活性,進(jìn)而研究其體外對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成、黏附細(xì)胞、侵入細(xì)胞的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抗銅綠假單胞菌感染的新型抗體藥物提供研究基礎(chǔ)。本研究首先將編碼MFa及MFb的DNA序列分別合成后,插入到真核表達(dá)載體中,獲得重組質(zhì)粒,再通過(guò)聚乙烯亞胺(PEI)在HEK293E細(xì)胞中獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及表達(dá);表達(dá)的產(chǎn)物通過(guò)HiTrap MabSelect SuRe柱進(jìn)行純化,所得到的抗體通過(guò)SDS-PAGE分析純度以及BCA法測(cè)定蛋白含量。為了研究抗體與抗原的親和活性,對(duì)抗原PcrV與Alginate進(jìn)行制備。其中PcrV抗原選用pET28a質(zhì)粒作為載體,將PcrV目的序列插入到pET28a中構(gòu)建重組質(zhì)粒,進(jìn)而轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中,在15℃,0.5 mM IPTG的條件下進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)與PcrV融合表達(dá)的His-Tag標(biāo)簽進(jìn)行親和純化,并通過(guò)SDS-PAGE、BCA、HPLC對(duì)純化的PcrV進(jìn)行純度及含量的分析;Alginate通過(guò)EDC作用與BSA進(jìn)行偶聯(lián)以開(kāi)發(fā)針對(duì)MFb的Western blot及ELISA等檢測(cè)方法。對(duì)純化后的抗體通過(guò)Western blot、ELISA、表面等離子共振(SPR)檢測(cè)其與抗原的親和活性。我們進(jìn)一步對(duì)所制備的抗體MFa及MFb進(jìn)行體外對(duì)銅綠假單胞菌的活性研究,主要分以下幾個(gè)方面:MFa及MFb抗體對(duì)生物膜形成的影響、對(duì)已形成的生物膜的破壞作用、對(duì)銅綠假單胞菌黏附HeLa細(xì)胞影響、對(duì)銅綠假單胞菌侵入HeLa細(xì)胞的影響,以及對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬銅綠假單胞菌的影響。本研究獲得以下結(jié)果:一、成功制備了抗銅綠假單胞菌PcrV與Alginate的抗體MFa及MFb。親和力實(shí)驗(yàn)表明,MFa與PcrV抗原的親和常數(shù)K_D為492.2 nM,MFb與Alginate抗原的親和常數(shù)K_D為8.308 nM。二、抗體的體外生物學(xué)活性表明MFa與MFb均能夠降低銅綠假單胞菌生物膜的形成,降低銅綠假單胞菌對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附作用,并能夠降低銅綠假單胞菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵入作用,同時(shí)MFa與MFb單獨(dú)使用均能夠增加巨噬細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌的吞噬作用。綜上,本研究制備了靶向銅綠假單胞菌的scFv-Fv形式的抗體藥物分子MFa及MFb,它們分別靶向PcrV蛋白及Alginate,體外生物學(xué)活性分析表明兩個(gè)抗體均能夠在一定程度上作用于生物膜形成,降低胞內(nèi)寄生菌的形成,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用,提示其具有對(duì)銅綠假單胞菌引起的感染的潛在效用,具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗銅綠假單胞菌治療藥物的價(jià)值。
【圖文】：

銅綠假單胞菌生物膜[25]

3圖 1-2. 銅綠假單胞菌侵入細(xì)胞[31]Fig. 1-2. Pseudomonas aeruginosa invade mammal cells[31]
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2601039