【摘要】：瘧疾(malaria)是威脅全球公共衛(wèi)生安全的重要傳染病之一。2016年全球共發(fā)生2.16億瘧疾病例,死亡44.5萬人。在死亡病例中,超過90%為熱帶和亞熱帶地區(qū)的兒童~([1])。瘧疾由蚊子叮咬傳播、瘧原蟲感染引起,已經(jīng)明確的能夠感染人類的四種瘧原蟲中,惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的臨床癥狀最為嚴重。惡性瘧原蟲入侵紅細胞相關蛋白的多態(tài)性和免疫逃逸機制使得預防瘧疾疫苗的研發(fā)極具挑戰(zhàn)。近年來耐藥性瘧原蟲株和抗殺蟲劑蚊子的廣泛傳播,更使得全球瘧疾的防控面臨嚴峻的考驗。CD147為一種單次跨膜的糖蛋白,在紅細胞表面廣泛表達。研究表明,CD147在惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細胞的過程中作為受體發(fā)揮了關鍵的作用,敲除CD147和靶向CD147的抗體均能有效阻止惡性瘧原蟲的入侵。6H8為本實驗室自主研發(fā)的靶向CD147的鼠源單克隆抗體,其人源化抗體命名為HP6H8。體外和人源化動物模型的實驗表明,6H8對惡性瘧原蟲感染具有良好的預防和治療作用,且在急性毒力試驗中表現(xiàn)出良好的安全性。利用6H8抗體靶向宿主CD147分子進行瘧疾的預防和治療,能夠避免惡性瘧原蟲的抗藥性和化學類藥物可能的副作用,具有很好的臨床應用前景。然而6H8識別CD147的表位尚未確定,其發(fā)揮功能的分子機制也不明確,因此本課題擬利用X射線晶體學的方法解析CD147-6H8抗原抗體復合物的三維結構,為闡明抗體功能機制、抗體的進一步改造和開發(fā)具有抗瘧疾作用的模擬肽藥物奠定結構基礎。本課題主要包括三部分工作:第一部分,CD147和6H8抗原抗體復合物的制備。我們利用原核表達系統(tǒng)對密碼子優(yōu)化過的完整的CD147胞外段及其兩個Ig結構域分別進行表達,并采用鎳柱親和層析-陰離子交換層析-凝膠排阻層析的策略進行純化;對6H8抗體進行木瓜蛋白酶酶切后使用陽離子交換層析-凝膠排阻層析進行Fab段的純化;對6H8抗體Fv段進行三維建模后進行表位預測并結合His Pull Down實驗證實6H8抗體識別的區(qū)域為CD147的Domain1(CD147D1);最后,分別將CD147胞外段和CD147D1同6H8抗體Fab段孵育后利用凝膠排阻層析制備出純度大于95%且均一性良好的抗原抗體復合物。第二部分,抗原抗體復合物及單獨Fab段的結晶及結構解析。我們對CD147-6H8Fab、CD147D1-6H8Fab和未結合抗原的Fab段分別進行了結晶條件的篩選和優(yōu)化,利用分子置換法計算相位,最終成功解析了2.6?分辨率的CD147D1-Fab復合物和1.45?分辨率Fab段的晶體結構。兩個結構模型的溫度因子和立體化學相關參數(shù)均處于合理范圍,能夠用于結構的精細分析。第三部分,晶體結構分析和6H8抗惡性瘧疾分子機制初步研究。對復合物的結構分析表明,抗體6H8通過CDR區(qū)形成的結合口袋,同CD147的~(60)Val-Val-Leu-Lys-Glu-Asp-Ala-Leu-Pro-Gly-Glu-Phe-Lys~(75)表位產(chǎn)生鹽橋、氫鍵和非氫鍵相互作用,尤其是抗體CDR-H3帶負電的Asp~(H102)同CD147帶正電的Lys~(63)形成的具有很強靜電吸引力的鹽橋,對于6H8抗體和CD147間的高親和力至關重要;抗原抗體在自由狀態(tài)和形成復合物后的結構和溫度因子比對表明,6H8和CD147相互作用部分關鍵氨基酸殘基側鏈在復合物形成時產(chǎn)生了較大位移,提示結合過程中發(fā)生了誘導契合。為了探究6H8發(fā)揮抗瘧功能的可能機制,我們將CD147D1-Fab復合物結構同已經(jīng)得到解析的CD147-PfRH5的結構進行重疊比對,結果表明6H8抗體并不影響CD147同瘧原蟲入侵關鍵蛋白PfRh5的相互作用,利用真核表達的PfRH5同CD147-6H8復合物進行SPR實驗進一步證實了此結論。進一步研究發(fā)現(xiàn),人工合成的CD147的表位肽在體外具有抑制惡性瘧原蟲入侵紅細胞的功能,這證明了6H8抗體抑制瘧原蟲入侵紅細胞的機制既不是阻斷CD147同其瘧原蟲配體蛋白PfRh5的相互作用,也非單純的空間位阻作用,而是很有可能阻斷了CD147同其它瘧原蟲入侵相關的蛋白的結合。
【圖文】：

圖 1 2015 年瘧疾在全球瘧原蟲危險區(qū)每 1000 人的發(fā)病率分布（World Bank, https://ourworldindata.org/malaria）1.2 惡性瘧原蟲的生活史瘧原蟲的生活史非常復雜，涉及到人和按蚊體內的不同組織，其完整的生活史如圖 2 所示。首先瘧原蟲的成熟子孢子（sporozoite）在按蚊叮咬人體的過程中被注入血液，并很快入侵肝實質細胞，數(shù)天后通過裂體生殖生成數(shù)千個裂殖子[7]（mero-zoites），并脹破肝實質細胞釋放入血。血液中的裂殖子能夠非常迅速地入侵紅細胞并開始其紅內期的發(fā)育：裂殖子在紅細胞內先形成早期滋養(yǎng)體，此時其胞質少且中間有空泡形似戒指，因而也稱為環(huán)形體（ring stage）；環(huán)形體進一步發(fā)育形成滋養(yǎng)體（trophozoite），其細胞質增多且體積變大，呈現(xiàn)黃褐色的空泡狀，并有瘧色素顆粒；滋養(yǎng)體進而發(fā)育為裂殖體（schizont）并隨著細胞質的進一步增大開始進行核分裂和胞質分裂，形成含有 16-32 個裂殖子的成熟裂殖體[8]；裂殖子成熟后在蛋白酶的作用

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文酸化而被激活的[31, 32]。例如，AMA1-RON 復合物對裂殖子和紅細胞緊密連接的形成和入侵過程中發(fā)揮關鍵作用，研究發(fā)現(xiàn) AMA1 的功能依賴于 PfPKA 催化的胞內段的磷酸化[33]及進一步的磷酸化級聯(lián)反應[34]。裂殖子入侵過程不僅涉及自身的信號傳導，，還能夠主動激活紅細胞內的信號轉導。有研究表明裂殖子能夠通過同紅細胞表面的受體相互作用誘導紅細胞內的磷酸化級聯(lián)反應，改變細胞膜的可變形性和細胞骨架的重排從而為入侵提供額外動力[35, 36]。例如裂殖子表面的 EBA175 同紅細胞表面受體血型糖蛋白 A 相互作用能夠增加紅細胞骨架的張力，減少細胞膜的彎曲度從而有利于入侵[37]。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2600906