發(fā)布時間：2020-03-26 03:47

【摘要】：瘧疾(malaria)是威脅全球公共衛(wèi)生安全的重要傳染病之一。2016年全球共發(fā)生2.16億瘧疾病例,死亡44.5萬人。在死亡病例中,超過90%為熱帶和亞熱帶地區(qū)的兒童~([1])。瘧疾由蚊子叮咬傳播、瘧原蟲感染引起,已經(jīng)明確的能夠感染人類的四種瘧原蟲中,惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的臨床癥狀最為嚴(yán)重。惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞相關(guān)蛋白的多態(tài)性和免疫逃逸機(jī)制使得預(yù)防瘧疾疫苗的研發(fā)極具挑戰(zhàn)。近年來耐藥性瘧原蟲株和抗殺蟲劑蚊子的廣泛傳播,更使得全球瘧疾的防控面臨嚴(yán)峻的考驗。CD147為一種單次跨膜的糖蛋白,在紅細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。研究表明,CD147在惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞的過程中作為受體發(fā)揮了關(guān)鍵的作用,敲除CD147和靶向CD147的抗體均能有效阻止惡性瘧原蟲的入侵。6H8為本實驗室自主研發(fā)的靶向CD147的鼠源單克隆抗體,其人源化抗體命名為HP6H8。體外和人源化動物模型的實驗表明,6H8對惡性瘧原蟲感染具有良好的預(yù)防和治療作用,且在急性毒力試驗中表現(xiàn)出良好的安全性。利用6H8抗體靶向宿主CD147分子進(jìn)行瘧疾的預(yù)防和治療,能夠避免惡性瘧原蟲的抗藥性和化學(xué)類藥物可能的副作用,具有很好的臨床應(yīng)用前景。然而6H8識別CD147的表位尚未確定,其發(fā)揮功能的分子機(jī)制也不明確,因此本課題擬利用X射線晶體學(xué)的方法解析CD147-6H8抗原抗體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu),為闡明抗體功能機(jī)制、抗體的進(jìn)一步改造和開發(fā)具有抗瘧疾作用的模擬肽藥物奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本課題主要包括三部分工作:第一部分,CD147和6H8抗原抗體復(fù)合物的制備。我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)對密碼子優(yōu)化過的完整的CD147胞外段及其兩個Ig結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行表達(dá),并采用鎳柱親和層析-陰離子交換層析-凝膠排阻層析的策略進(jìn)行純化;對6H8抗體進(jìn)行木瓜蛋白酶酶切后使用陽離子交換層析-凝膠排阻層析進(jìn)行Fab段的純化;對6H8抗體Fv段進(jìn)行三維建模后進(jìn)行表位預(yù)測并結(jié)合His Pull Down實驗證實6H8抗體識別的區(qū)域為CD147的Domain1(CD147D1);最后,分別將CD147胞外段和CD147D1同6H8抗體Fab段孵育后利用凝膠排阻層析制備出純度大于95%且均一性良好的抗原抗體復(fù)合物。第二部分,抗原抗體復(fù)合物及單獨Fab段的結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析。我們對CD147-6H8Fab、CD147D1-6H8Fab和未結(jié)合抗原的Fab段分別進(jìn)行了結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化,利用分子置換法計算相位,最終成功解析了2.6?分辨率的CD147D1-Fab復(fù)合物和1.45?分辨率Fab段的晶體結(jié)構(gòu)。兩個結(jié)構(gòu)模型的溫度因子和立體化學(xué)相關(guān)參數(shù)均處于合理范圍,能夠用于結(jié)構(gòu)的精細(xì)分析。第三部分,晶體結(jié)構(gòu)分析和6H8抗惡性瘧疾分子機(jī)制初步研究。對復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析表明,抗體6H8通過CDR區(qū)形成的結(jié)合口袋,同CD147的~(60)Val-Val-Leu-Lys-Glu-Asp-Ala-Leu-Pro-Gly-Glu-Phe-Lys~(75)表位產(chǎn)生鹽橋、氫鍵和非氫鍵相互作用,尤其是抗體CDR-H3帶負(fù)電的Asp~(H102)同CD147帶正電的Lys~(63)形成的具有很強(qiáng)靜電吸引力的鹽橋,對于6H8抗體和CD147間的高親和力至關(guān)重要;抗原抗體在自由狀態(tài)和形成復(fù)合物后的結(jié)構(gòu)和溫度因子比對表明,6H8和CD147相互作用部分關(guān)鍵氨基酸殘基側(cè)鏈在復(fù)合物形成時產(chǎn)生了較大位移,提示結(jié)合過程中發(fā)生了誘導(dǎo)契合。為了探究6H8發(fā)揮抗瘧功能的可能機(jī)制,我們將CD147D1-Fab復(fù)合物結(jié)構(gòu)同已經(jīng)得到解析的CD147-PfRH5的結(jié)構(gòu)進(jìn)行重疊比對,結(jié)果表明6H8抗體并不影響CD147同瘧原蟲入侵關(guān)鍵蛋白PfRh5的相互作用,利用真核表達(dá)的PfRH5同CD147-6H8復(fù)合物進(jìn)行SPR實驗進(jìn)一步證實了此結(jié)論。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),人工合成的CD147的表位肽在體外具有抑制惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的功能,這證明了6H8抗體抑制瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的機(jī)制既不是阻斷CD147同其瘧原蟲配體蛋白PfRh5的相互作用,也非單純的空間位阻作用,而是很有可能阻斷了CD147同其它瘧原蟲入侵相關(guān)的蛋白的結(jié)合。
【圖文】：

圖 1 2015 年瘧疾在全球瘧原蟲危險區(qū)每 1000 人的發(fā)病率分布（World Bank, https://ourworldindata.org/malaria）1.2 惡性瘧原蟲的生活史瘧原蟲的生活史非常復(fù)雜，涉及到人和按蚊體內(nèi)的不同組織，其完整的生活史如圖 2 所示。首先瘧原蟲的成熟子孢子（sporozoite）在按蚊叮咬人體的過程中被注入血液，并很快入侵肝實質(zhì)細(xì)胞，數(shù)天后通過裂體生殖生成數(shù)千個裂殖子[7]（mero-zoites），并脹破肝實質(zhì)細(xì)胞釋放入血。血液中的裂殖子能夠非常迅速地入侵紅細(xì)胞并開始其紅內(nèi)期的發(fā)育：裂殖子在紅細(xì)胞內(nèi)先形成早期滋養(yǎng)體，此時其胞質(zhì)少且中間有空泡形似戒指，因而也稱為環(huán)形體（ring stage）；環(huán)形體進(jìn)一步發(fā)育形成滋養(yǎng)體（trophozoite），其細(xì)胞質(zhì)增多且體積變大，呈現(xiàn)黃褐色的空泡狀，并有瘧色素顆粒；滋養(yǎng)體進(jìn)而發(fā)育為裂殖體（schizont）并隨著細(xì)胞質(zhì)的進(jìn)一步增大開始進(jìn)行核分裂和胞質(zhì)分裂，形成含有 16-32 個裂殖子的成熟裂殖體[8]；裂殖子成熟后在蛋白酶的作用

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文酸化而被激活的[31, 32]。例如，AMA1-RON 復(fù)合物對裂殖子和紅細(xì)胞緊密連接的形成和入侵過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn) AMA1 的功能依賴于 PfPKA 催化的胞內(nèi)段的磷酸化[33]及進(jìn)一步的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)[34]。裂殖子入侵過程不僅涉及自身的信號傳導(dǎo)，，還能夠主動激活紅細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究表明裂殖子能夠通過同紅細(xì)胞表面的受體相互作用誘導(dǎo)紅細(xì)胞內(nèi)的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的可變形性和細(xì)胞骨架的重排從而為入侵提供額外動力[35, 36]。例如裂殖子表面的 EBA175 同紅細(xì)胞表面受體血型糖蛋白 A 相互作用能夠增加紅細(xì)胞骨架的張力，減少細(xì)胞膜的彎曲度從而有利于入侵[37]。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2600906