【摘要】：毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生基因2(capillary morphogenesis gene 2,CMG2),為I型跨膜蛋白,全長形式由489個氨基酸組成(CMG2~(489)),基因定位于4q21。CMG2最初由于其參與毛細(xì)血管的發(fā)生而被發(fā)現(xiàn),后來被證實(shí)為炭疽毒素的第二種受體,故又稱為炭疽毒素受體2(anthrax toxin receptor 2,ANTXR2)。盡管CMG2的確切生理功能尚未明了,但業(yè)已證明,該基因的突變可引起幼年透明性纖維瘤病(Juvenile Hyaline Fibromatosis)和小兒玻璃樣纖維瘤病(Infantile Hyaline Fibromatosis)。近年來,CMG2在腫瘤中的作用已引起關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),CMG2在胃癌組織高表達(dá),是一個新的功能性的胃癌干細(xì)胞(gastric cancer stem cells,GCSCs)表面標(biāo)志物,參與胃癌干細(xì)胞的干性維持,促進(jìn)胃癌進(jìn)展,并能充當(dāng)胃癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子。本研究所另一課題組的研究還發(fā)現(xiàn),CMG2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的級別和預(yù)后密切相關(guān)。這些研究結(jié)果表明CMG2在胃癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是潛在的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。CMG2在腫瘤中的作用值得深入研究,然而,開展這些研究離不開高特異高親和力的抗CMG2抗體。至今,國際國內(nèi)商品化抗CMG2抗體大多為多克隆抗體,只有Abcam公司供應(yīng)兔抗人CMG2單克隆抗體。因此,開發(fā)CMG2單克隆抗體具有良好的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用前景。研究目的制備高特異性和高親和力的小鼠抗人CMG2單克隆抗體,并用其建立CMG2表達(dá)的免疫印跡、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測方法,探討其應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞和組織中CMG2表達(dá)檢測的可行性。主要方法1.重組CMG2胞外段抗原多肽的原核表達(dá)與純化根據(jù)CMG2(UniProtKB-P58335)的序列信息及在線表位預(yù)測結(jié)果,設(shè)計(jì)抗原多肽,包括CMG2胞外段(CMG2-ex)和優(yōu)勢表位肽,并實(shí)現(xiàn)其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá),以鎳柱純化表達(dá)產(chǎn)物,BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE檢測純度。2.小鼠免疫、雜交瘤細(xì)胞制備及篩選、腹水制備和單抗純化選擇免疫原性最強(qiáng)的抗原多肽為免疫原,常規(guī)免疫小鼠和制備雜交瘤細(xì)胞。使用外購的真核表達(dá)的CMG2胞外段肽作為篩選原,通過間接ELISA方法篩選目標(biāo)克隆。常規(guī)制備小鼠腹水并經(jīng)Protein A親和純化獲得相應(yīng)抗體。3.抗體特性鑒定以間接ELISA法鑒定抗體亞類和親和力,抗原競爭性抑制實(shí)驗(yàn)鑒定抗體的特異性。4.以候選單抗為一抗的檢測方法的建立用候選單抗為一抗,建立免疫印跡法、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及免疫組化方法。5.以候選單抗建立的檢測方法的初步應(yīng)用以已知表達(dá)CMG2的胃癌細(xì)胞系SGC7901細(xì)胞和胃癌原代細(xì)胞XN0422作為模型,考察所建立的免疫印跡法、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)方法的檢測效果。以所建立的免疫組化方法對162例胃癌組織芯片、多器官腫瘤組織芯片和多器官正常組織芯片進(jìn)行CMG2表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測,考察染色的特異性和靈敏度。對帶有病理參數(shù)和隨訪資料的胃癌樣本,統(tǒng)計(jì)分析CMG2表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性,以及與病人預(yù)后的關(guān)系。6.候選單抗對胃癌細(xì)胞的抑制作用在兩種胃癌細(xì)胞中加入高低兩種濃度的候選抗體,孵育4d,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),分析候選單抗對腫瘤細(xì)胞是否具有抑制作用。結(jié)果1.通過對CMG2胞外段的表位分析,設(shè)計(jì)出CMG2-ex(34-318 aa)、CMG2 epitope1(94-139 aa)、CMG2-epitope2(153-200 aa)和CMG2-epitope3(261-306 aa)4個抗原多肽,并實(shí)現(xiàn)了其在原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)。經(jīng)鎳柱純化后的抗原肽純度均超過90%,濃度均超過2mg/mL,完全滿足制備單抗的需要。動物免疫鑒定結(jié)果顯示,CMG2-ex具有最強(qiáng)的免疫原性而被確定為制備單抗時(shí)的免疫原。2.以CMG2-ex為免疫原,以真核表達(dá)CMG2胞外段肽為篩選原,共篩選獲得3株單克隆抗體,分別命名為2F8、6A7和8F3。特性鑒定顯示8F3單抗的特異性和親和力均顯著優(yōu)于2F8和6A7單抗,且其亞型為IgG1,被確定為候選的目標(biāo)抗體。3.用8F3單抗建立的免疫印跡、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)方法檢測CMG2在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá),結(jié)果表明8F3單抗能很好地應(yīng)用于免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測方法,但不能用于免疫印跡法檢測,提示其針對是構(gòu)象表位。4.以8F3單抗建立的免疫組化方法具有良好的應(yīng)用效果和臨床應(yīng)用前景。以8F3抗體為一抗檢測162例胃癌組織芯片中CMG2的表達(dá),結(jié)果顯示,染色主要在胞膜和胞漿,無非特異染色。胃癌組織中CMG2表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織,且CMG2高表達(dá)患者的無病生存期和總生存期均顯著短于CMG2低表達(dá)者。Cox單因素和多因素分析顯示,CMG2表達(dá)水平是患者的獨(dú)立預(yù)后因子。這些結(jié)果與本課題組前期采用Proteintech公司的CMG2多抗檢測結(jié)果相一致。此外,用8F3抗體為一抗對人多種正常組織芯片和人多癌種組織芯片的組化檢測結(jié)果顯示,大多數(shù)正常組織呈弱陽性或陰性反應(yīng),而不同腫瘤組織呈現(xiàn)不同的CMG2表達(dá)水平。5.8F3抗體對胃癌細(xì)胞無明顯的抑制作用,表明8F3不能作為中和阻斷抗體所用。結(jié)論成功制備出高特異性和高親和力的8F3鼠抗人CMG2單克隆抗體,能用于CMG2表達(dá)的免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測,但不能應(yīng)用于免疫印跡法檢測。
【圖文】：

圖 2-1 IEDB 數(shù)據(jù)庫 CMG2 胞外區(qū) B 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果A：蛋白結(jié)構(gòu) β 轉(zhuǎn)角 B：蛋白表面可及性 C：蛋白柔韌性 D：蛋白質(zhì)親疏水性表 2-1 CMG2 重組表達(dá)蛋白氨基酸序列NO.StartPositionEndPositionPeptidePeptidLengtCMG2-ex 34 318QEQPSCRRAFDLYFVLDKSGSVANNWIEIYNFVQQLAERFVSPEMRLSFIVFSSQATIILPLTGDRGKISKGLEDLKRVSPVGETYIHEGLKLANEQIQKAGGLKTSSIIIALTDGKLDGLVPSYAEKEAKISRSLGASVYCVGVLDFEQAQLERIADSKEQVFPVKGGFQALKGIINSILAQSCTEILELQPSSVCVGEEFQIVLSGRGFMLGSRNGSVLCTYTVNETYTTSVKPVSVQLNSMLCPAPILNKAGETLDVSVSFNGGKSVISGSLIVTATECSNG285CMG2-epitope1 94 139PLTGDRGKISKGLEDLKRVSPVGETYIHEGLKLA46

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基因由南京金斯瑞合成并插入 pUC57 質(zhì)粒。將收到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH切后進(jìn)行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段正確，CMG2-ex、CMG2度分別為 873bp、527bp、545bp 和 527b。對目的片段進(jìn)行膠回收后載體，構(gòu)建 CMG2-ex-pET32a、CMG2-epitope1-pET22b、CMG2-epitopitope3-pET22b 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 DH5α。對提取的擴(kuò)增質(zhì)粒進(jìn)行雙酶大小一致的目的片段（圖 2-2），重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2600418