發(fā)布時間：2020-03-25 18:19

【摘要】：隨著我國逐漸步入老齡化社會,一系列老年病(如腦梗塞、腦出血、阿爾茨海默病、帕金森病等)的發(fā)病率逐年升高,患者人群也逐漸擴(kuò)大。無論是腦卒中類的急性腦損傷還是阿爾茨海默病這類的慢性神經(jīng)退行性疾病損傷,都與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的過度(急性損傷)與持續(xù)(慢性損傷)激活密不可分。炎癥反應(yīng)是急慢性腦損傷病理生理學(xué)特征的重要組成部分。因此,有效調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)是開發(fā)急慢性腦損傷治療藥物的重要方向。由于血腦屏障的存在,外周循環(huán)系統(tǒng)中的固有免疫相關(guān)細(xì)胞無法有效進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。故此,膠質(zhì)細(xì)胞,特別是小膠質(zhì)細(xì)胞,成為了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的主要參與者。多種鼠源永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系(如BV2)在過去很多年都是進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)理的重要研究工具。但近年來,本領(lǐng)域研究者逐漸發(fā)現(xiàn),鼠源小膠質(zhì)細(xì)胞與人小膠質(zhì)細(xì)胞在基因表達(dá)譜、炎癥反應(yīng)強(qiáng)度、刺激因子選擇性等方面存在顯著差異�；谑笤葱∧z質(zhì)細(xì)胞的研究亦很難為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)產(chǎn)生有價值的候選藥物分子。同時,由于人原代膠質(zhì)細(xì)胞的獲取困難、干細(xì)胞分化小膠質(zhì)細(xì)胞的成本高企,鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞與人源小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸變?yōu)楸绢I(lǐng)域研究的首選工具。但當(dāng)前研究方法仍較為粗放,人源小膠質(zhì)細(xì)胞系研究較少,鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已十幾年未有更新,難以有效模擬體內(nèi)狀態(tài)。鑒于此,本項目的主要研究目的是:1)針對加拿大Abm Goods公司近期推出的新型人永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系HM-SV40建立并優(yōu)化體外培養(yǎng)與炎癥反應(yīng)模型技術(shù);2)將最新細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、材料以及最新的多因子檢測技術(shù)用于優(yōu)化鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與炎癥模型技術(shù)。第一部分,建立并優(yōu)化了新型人源永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系HM-SV40的體外炎癥模型。首先通過對HM-SV40細(xì)胞進(jìn)行qPCR檢測,確定其小膠質(zhì)細(xì)胞特異性生物標(biāo)記物(如TREM2)的表達(dá);同時,表征結(jié)果也顯示HM-SV40細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)的調(diào)控(LDLR)與激活(TLR)家族基因。為了建立該細(xì)胞系的炎癥模型,我們首先采用經(jīng)典的刺激分子(LPS、Poly(I:C)、PHA)對HM-SV40進(jìn)行處理,qPCR和ELISA檢測結(jié)果顯示,上述經(jīng)典的炎癥刺激分子均不能成功激活該細(xì)胞。而后,我們對HM-SV40的激活條件進(jìn)行了大量的摸索及優(yōu)化,通過將鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)狀態(tài)的條件培養(yǎng)基加入到HM-SV40的培養(yǎng)體系中,成功實現(xiàn)了對HM-SV40細(xì)胞的激活。借助諸如Luminex多因子液相芯片分析等手段,我們從上述條件培養(yǎng)基中逐漸縮小搜索范圍,最終確定了TNF-α與IFN-γ可激活HM-SV40細(xì)胞,并從蛋白水平(多因子液相芯片分析)與基因轉(zhuǎn)錄組水平(RNA-sequencing)對HM-SV40細(xì)胞體外炎癥模型進(jìn)行了全面驗證與表征。本部分研究為人源小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的建立,提供了一個新的思路。第二部分,我們分別采用震搖法和磁珠分選法獲得大小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞,并成功建立炎癥模型。經(jīng)驗證,而ApoE擬肽COG1410可顯著抑制LPS的作用。進(jìn)一步地,我們針對原代混合膠質(zhì)細(xì)胞普遍存在的批間穩(wěn)定性差等問題,對培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境表面材料等因素進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化。結(jié)果顯示,生長于新的Matrigel材料包被的細(xì)胞培養(yǎng)板上的鼠原代膠質(zhì)細(xì)胞,相較于傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞更大程度的模擬了體內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的行為,并驗證了小膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞間存在顯著的協(xié)同作用。本部分研究為鼠原代膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與炎癥模型研究提供了一套新的更優(yōu)化的技術(shù)方法。第三部分,以經(jīng)典鼠源永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2炎癥模型對目前在美國處于臨床二期試驗的載脂蛋白E(apoE)模擬多肽CN-105進(jìn)行了初步研究。研究表明CN-105并不能抑制BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。第四部分,通過表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance,SPR),測定多種ApoE模擬多肽與LDLR相關(guān)受體1(LRP1)的配體結(jié)合區(qū)(LRP1-CR)的體外結(jié)合情況。結(jié)果顯示,ApoE蛋白、模擬多肽COG1410均可與LRP1結(jié)合,但未檢測到CN-105與任何LRP1-CR的結(jié)合信號。綜上所述,本文所述研究主要對新型人源永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系HM-SV40與鼠原代膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與炎癥模型技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性開發(fā)與優(yōu)化,為未來的神經(jīng)系統(tǒng)體外炎癥模型研究提供了一些新的指引。同時通過對ApoE模擬多肽CN-105的細(xì)胞學(xué)與生物物理學(xué)初步研究,對原ApoE模擬多肽假設(shè)提出了質(zhì)疑。
【圖文】：

圖 1. 小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備流程Figure 1. Microglia conditional medium preparation process(2) 分別使用 BV2 和 RAW264.7 制備的 MCM 處理 HM-SV40，，且以正常培養(yǎng)、加入無刺激分子處理的條件培養(yǎng)基處理 HM-SV40 作為對照；考察 LPS 和 Poly(I:C)兩種刺激分子制備的 MCM 有無差異，同時考察了不同代數(shù)的鼠源細(xì)胞制備的MCM 對 HM-SV40 的影響，及不同代數(shù)的 HM-SV40 對 MCM 的敏感性有無差異；(3) RNA 提�。簠⒄� RNA 提取試劑盒提取所有樣品的總 RNA，并使用超微量紫外分光光度計測量提取 RNA 的濃度；(4) 反轉(zhuǎn)錄：通過 RNA 濃度計算反轉(zhuǎn)錄 1 μg 需要的 RNA 量，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA；(5) qPCR 檢測：采用染料法進(jìn)行 qPCR 檢測，以管家基因 RPL27 為內(nèi)參，檢測不同濃度 LPS 處理 HM-SV40 不同時間點樣品 IL1α 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。引物序

HM-SV40鑒定Fig2.IdentificationofHM-SV40PG0F----++SFM--++--LPS-+-+-+
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741;R-332

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本文編號：2600253