【摘要】：目的通過檢測SUMO特異性蛋白酶1(SUMO-specific proteases 1,SENP1)、小泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier-1,SUMO1)在肺發(fā)育過程中的表達(dá)變化,明確SENP1、SUMO1參與調(diào)控肺發(fā)育,再進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AECⅡ),研究AECⅡ分化過程中SENP1表達(dá)變化,和抑制SENP1對細(xì)胞生長及分化的影響,來探討SENP1在肺發(fā)育過程中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部分,根據(jù)大鼠肺發(fā)育的不同階段,于生后1 d、4 d、7 d、14d處死新生大鼠取肺組織,通過HE染色法觀察不同時(shí)期肺的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,用RT-qPCR、Western blot檢測SUMO1和SENP1 mRNA及蛋白在肺發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)變化。第二部分,體外培養(yǎng)AECⅡ時(shí),通過加入維甲酸(Retinoic acid,RA)促進(jìn)細(xì)胞分化,并使用細(xì)胞免疫熒光法和Western bolt檢測肺表面活性蛋白C(Surfactant Protein C,SP-C)、水通道蛋白5(aquaporin,AQP5)表達(dá)變化,證明RA促分化的作用;進(jìn)一步在RA促進(jìn)AECⅡ分化的基礎(chǔ)上,通過siRNA轉(zhuǎn)染法抑制SENP1表達(dá),檢測SP-C、AQP5及SUMO1表達(dá)變化,研究抑制SENP1對細(xì)胞分化的影響;同時(shí)通過CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制SENP1對AECⅡ增殖、凋亡的影響。結(jié)果(1)生后14 d內(nèi),SUMO1 mRNA穩(wěn)定表達(dá)(P0.05),生后4 d肺組織中游離SUMO1蛋白表達(dá)較生后1 d及7 d均明顯升高(P0.05)。進(jìn)一步檢測不同狀態(tài)SUMO1蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),生后4 d、14 d,肺組織SUMO1總蛋白表達(dá)無明顯變化,游離SUMO1表達(dá)減少,SUMO1結(jié)合蛋白表達(dá)增加(P0.05)。而SENP1蛋白及mRNA表達(dá)變化與游離SUMO1變化趨勢一致(P0.05)。(2)免疫熒光及Western bolt檢測RA對AECⅡ分化的影響。免疫熒光結(jié)果顯示,與同時(shí)間點(diǎn)對照組相比較,均表現(xiàn)為RA組SP-C表達(dá)比例降低,AQP5表達(dá)比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western bolt結(jié)果示,與對照組相比,培養(yǎng)24 h和72 h時(shí),RA組SP-C蛋白表達(dá)減少,48 h時(shí)SP-C蛋白表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比,RA組AQP5表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);各時(shí)間點(diǎn)RA組SENP1表達(dá)均較對照組增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)進(jìn)一步在RA促分化的基礎(chǔ)上抑制SENP1表達(dá),與RA+si?NS組相比,SP?C蛋白在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);各時(shí)間點(diǎn)RA+si-SENP1組AQP5蛋白表達(dá)均較RA+si-NS組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);培養(yǎng)48 h時(shí)檢測抑制SENP1對蛋白SUMO化的影響,隨著SENP1表達(dá)被抑制,SUMO1結(jié)合蛋白(conjugated SUMO1)表達(dá)增多,游離SUMO1(free SUMO1)表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)利用siRNA轉(zhuǎn)染抑制SENP1,發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)si-SENP1組細(xì)胞增殖水平均較si-NS組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各時(shí)間點(diǎn)siRNA抑制SENP1表達(dá)后,si-SENP1組細(xì)胞凋亡率均較si-NS組升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論(1)SENP1在大鼠肺發(fā)育的過程中動(dòng)態(tài)表達(dá),且與游離SUMO1表達(dá)趨勢一致,說明SENP1可能通過影響蛋白SUMO化修飾參與肺發(fā)育。(2)體外培養(yǎng)AECⅡ發(fā)現(xiàn)SENP1在細(xì)胞分化過程中表達(dá)增加,進(jìn)一步驗(yàn)證抑制SENP1對細(xì)胞分化的影響,發(fā)現(xiàn)SENP1表達(dá)降低可使AECⅡ分化受抑,同時(shí)SUMO1結(jié)合蛋白表達(dá)明顯增多,表明SENP1可能通過調(diào)控蛋白SUMO化修飾影響AECⅡ分化。(3)SENP1通過參與AECⅡ分化、增殖、凋亡在肺發(fā)育過程中起作用。
【圖文】：

SENP1 在肺發(fā)育過程中的作用及其對 AECⅡ分化的影響、14 d 大鼠肺組織 SUMO1 mRNA 相對表達(dá)量分別為 1、0.88±0、1.07±0.40，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。生后 14 d 內(nèi)大鼠肺RNA 表達(dá)先升后降，4 d 較 1 d 表達(dá)升高并達(dá)最高水平，7 d 較 4 d，其生后 1 d、4 d、7 d、14 d mRNA 相對表達(dá)值分別為 1、2.36±、0.68±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)；7 d、14 d 維持在一穩(wěn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見圖 1.2。

差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見圖 1.2。圖 1.1 HE 染色觀察肺發(fā)育不同時(shí)期形態(tài)變化（×400）A：生后 1 d B：生后 4 d C：生后 7d D 生后 14dFigure 1.1 Histology of transverse sections of isolated lungs from several stages ofdevelopment. （HE，，×400）
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R332.2

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