發(fā)布時間：2020-03-24 14:35

【摘要】：寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)為單股正鏈RNA病毒,主要通過蚊蟲媒介傳播。該病毒可以穿過血腦屏障,進(jìn)而引發(fā)一些神經(jīng)并發(fā)癥和先天性寨卡病毒綜合癥,并造成不可逆的神經(jīng)損害。隨著該病毒在全球范圍內(nèi)迅速蔓延,已引起國際衛(wèi)生組織的高度重視,然目前市場上卻沒有針對寨卡病毒的特異性藥物,因此尋求抗寨卡病毒藥物迫在眉睫。ZIKV NS3蛋白酶主要功能是將病毒形成的多聚蛋白切割為獨(dú)立的功能蛋白,是病毒復(fù)制所必需的,因此是一種潛在的抗病毒藥物靶標(biāo)。本研究開展了基于ZIKV NS2B-NS3蛋白酶活性的抗病毒抑制劑篩選。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法在體外檢測了該蛋白酶的活性,并由此建立了高通量篩選的方法。對本實(shí)驗(yàn)室保存的化合物進(jìn)行篩選,在復(fù)篩中獲得一些對該蛋白酶具有較好抑制作用的化合物,挑選出一種具有相對較好抑制作用的化合物在細(xì)胞水平和動物活體水平上進(jìn)行了抗病毒作用的研究。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的可溶性表達(dá)及化合物庫的高通量篩選本研究對表達(dá)載體、感受態(tài)菌株和誘導(dǎo)溫度、時間進(jìn)行了摸索,最終得到最優(yōu)的可溶性表達(dá)條件,并通過鎳柱親和層析方法純化得到了大量可溶性的ZIKVNS2B-NS3蛋白酶。然后運(yùn)用FRET方法檢測了ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的活性,并計算求得S/B=13.60和Z′=0.51,該值均符合高通量篩選要求,就對實(shí)驗(yàn)室保存的四千多種小分子化合物庫進(jìn)行了篩選。通過初篩和復(fù)篩,剔除本身帶熒光的假陽性化合物和加樣誤差造成的假陽性化合物,最終得到抑制率大于80%的十種小分子抑制劑。并將以上十種化合物在DENV、JEV和WNV NS3蛋白酶上進(jìn)行體外酶活抑制試驗(yàn),由試驗(yàn)可知,其中對DENV和JEV蛋白酶均有較好抑制作用的有八種化合物,而對WNV蛋白酶較好抑制作用的僅有三種。在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上我們挑選一種化合物CS-004/04003052進(jìn)行更深一步的研究。得到以下結(jié)果:2.化合物CS-004/04003052的酶動力學(xué)研究及其對ZIKV蛋白酶抑制作用的特異性將化合物進(jìn)行不同濃度的稀釋并在不同底物濃度下測蛋白酶的反應(yīng)速率,作反應(yīng)速率-底物濃度雙倒數(shù)曲線,根據(jù)米氏方程可知該化合物的抑制常數(shù)K_i值為0.1346±0.0243μM/L,且依據(jù)各直線相較于X軸,表明該化合物與底物之間是競爭性抑制作用。通過Microscale thermophoresis Test(MST)試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)測定了化合物的酶結(jié)合常數(shù)K_d值為12.262±5.549μM。其次我們將化合物CS-004/04003052分別在ZIKV、DENV、JEV NS3蛋白酶和PEDV NSP5蛋白酶上進(jìn)行體外酶活性抑制實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該化合物CS-004/04003052只對ZIKV NS3蛋白酶表現(xiàn)出高度特異性抑制作用。3.細(xì)胞水平抗病毒作用檢測將化合物CS-004/04003052倍比稀釋成200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.59μM八個濃度分別加入Vero、BHK-21、Hela細(xì)胞,待48h后,加入Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay試劑,然后加入等體積的檢測試劑,讀取并保存數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù),并計算CC50,結(jié)合測得的IC50可知,該化合物在較高濃度下仍對三種細(xì)胞的毒性甚小。通過分析空斑試驗(yàn)結(jié)果表明該化合物可抑制寨卡病毒的滴度;間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot試驗(yàn)結(jié)果均表明該化合物能抑制寨卡病毒的蛋白表達(dá)。同時我們也在細(xì)胞水平上探究了該化合物對乙腦病毒的復(fù)制是否存在抑制作用,結(jié)合空斑試驗(yàn)和Western blot試驗(yàn)結(jié)果均表明在細(xì)胞水平上該化合物對乙腦病毒的復(fù)制無抑制作用。4.動物水平抗病毒作用將化合物CS-004/04003052通過尾靜脈注射AG129小鼠,進(jìn)行抗寨卡病毒體內(nèi)作用研究。試驗(yàn)結(jié)果表明,病毒組該化合物能延緩感小鼠染寨卡病毒的死亡時間。且通過HE切片染色結(jié)果分析可知在腦、睪丸、卵巢和脾組織內(nèi),給藥組內(nèi)的病理癥狀與病毒組相比明顯得以改善;同時根據(jù)熒光定量PCR和空斑試驗(yàn)結(jié)果均表明在以上組織內(nèi)藥物組體內(nèi)病毒的含量顯著低于對照組。綜合分析可知化合物CS-004/04003052在動物活體水平上對寨卡病毒具有抑制作用。
【圖文】：

圖 1-1ZIKV 感染的全球分布圖（Song et al 2017）Fig.1-1 Global map of Zika virus infection（Song et al 2017）1.2.2 ZIKV 傳播媒介與方式

圖 1-2 ZIKV 在非洲森林和城市循環(huán)之間的傳播(Slavov et al 2016)Fig.1-2 Transmission of ZIKV in its African sylvatic and urban cycles（Slavov et al 2016）1.3 寨卡病毒的病原學(xué)特征1.3.1 寨卡病毒的基因組結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373
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本文編號：2598464