【摘要】：研究目的:近年來已有大量研究證明誘導多能干細胞(hi PSCs)來源的小胞外囊泡(s EVs)(hi PSCs-s EVs)在各類疾病中發(fā)揮治療作用,然而目前對于s EVs來源供體細胞的收集培養(yǎng)上清時所用培養(yǎng)液條件及細胞狀態(tài)并沒有明確的報道,因此本文研究的目的是探索在提取hi PSCs-s EVs時,hi PSCs的培養(yǎng)條件及其能否維持細胞的正常狀態(tài),以確保在減少外來物質對s EVs干擾的同時提取具有生物學活性的s EVs。1、根據(jù)hi PSCs的生長及分化狀態(tài)確定收集培養(yǎng)上清時所需條件培養(yǎng)基的組成;2、進一步確定可收集培養(yǎng)上清的天數(shù);3、改良s EVs的提取方法提取hi PSCs來源的s EVs;4、通過檢測形態(tài)、大小等驗證提取的s EVs的物理學特性;5、驗證s EVs表面標志蛋白的表達;6、利用Hep G2細胞證明提取的s EVs的生物學活性。研究方法:1、利用連續(xù)16h超速離心法制備去除細胞外囊泡的血清替代物(KSR)(ED-KSR);2、配制含有不同濃度(0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%)ED-KSR的條件培養(yǎng)基(CM);3、hi PSCs生長至一定密度后更換不同濃度CM,24h后利用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞儀檢測不同濃度CM中細胞的生存率,BCA和SDS-PAGE分別測定不同濃度CM中提取出的s EVs蛋白濃度以及條帶分布,并確定最適宜的ED-KSR濃度;4、在0.5%CM中連續(xù)收集培養(yǎng)上清5d,并利用流式細胞儀測定分別收集1d,3d,5d時hi PSCs的存活率,堿性磷酸酶染色(ALP)、干性標志物OCT4、SEEA4和SOX2的免疫熒光染色、干性標志物NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析檢測hi PSCs的多能性,確定收集培養(yǎng)上清的時間;5、采用改良的超速離心法(M-UC)和Exo-Quick試劑盒(EQ)提取s EVs,并利用透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析(NTA)、蛋白印跡(WB)驗證所提取的s EVs的大小、形態(tài)以及蛋白表達;6、PKH67標記s EVs,鑒定是否能被受體細胞Hep G2攝取;7、不同濃度的s EVs加入到Hep G2中,觀察其對受體細胞的作用。研究結果:更換0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%六種濃度ED-KSR配制的CM 24h后,相差顯微鏡下觀察兩株hi PSCs的形態(tài),發(fā)現(xiàn)與干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hi PSCs相比,0.5%、2%、5%和20%CM中的細胞形態(tài)沒有顯著變化,均呈特征性的未分化狀態(tài),且流式細胞儀檢測結果的數(shù)據(jù)分析顯示各組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),然而,0%和0.25%CM中hi PSCs的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生輕微改變,并開始出現(xiàn)分化現(xiàn)象,細胞存活率也顯著低于對照組(P0.05);BCA結果顯示0.5%、2%、5%和20%CM中收集的來源于兩株hi PSCs的s EVs的蛋白濃度分別為4.36±0.53、7.5±2.0、10.2±1.2、14.99±1.12;4.36±0.54、7.14±0.68、10.67±1.84、13.63±0.06,各組間差異顯著(P0.05),且SDS-PAGE結果也顯示KSR中的蛋白對0.5%CM中提取的s EVs干擾最小,上述結果均表明0.5%ED-KSR為適宜的CM濃度;隨后在0.5%CM中連續(xù)收集培養(yǎng)上清5天后,發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)無明顯變化,且流式細胞儀檢測結果顯示hi PSCs的存活率有浮動,但數(shù)據(jù)分析顯示此差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);堿性磷酸酶染色、OCT4、SEEA4和SOX2的免疫熒光、NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析結果均顯示hi PSCs在收集5天后仍表達hi PSCs多能性標志,呈未分化狀態(tài);采用M-UC和EQ兩種方法提取s EVs,TEM結果顯示提取的s EVs均為50-200nm,橢圓形或圓形的雙層膜性小囊泡,NTA結果顯示兩種方法提取的s EVs大小分別為186.6±2.6 nm、167.5±2.0 nm,;Western Blotting結果顯示兩株hi PSCs細胞來源的s EVs表達標記蛋白CD63,TSG101和HSP70,不表達鈣網(wǎng)蛋白Calreticulin;另外,PKH67染色實驗表明,s EVs可被受體細胞Hep G2內吞,并以顆粒形式聚集在細胞質中,且達到一定濃度的s EVs可以促進細胞增殖。研究結論:在維持hi PSCs多能性及存活率的條件下,0.5%ED-KSR為收集hi PSCs培養(yǎng)上清時所用條件培養(yǎng)基的適宜濃度,并且可連續(xù)收集5天;M-UC和EQ兩種方法均可提取具有促進受體細胞增殖的生物活性的s EVs,為后續(xù)的功能研究提供基礎。
【圖文】：

12圖 1.1 小胞外囊泡（sEVs）的提取方法檢測RIPA 裂解液（Radio Immunoprecipitation Assaris (pH 7.4) 、 150mM NaCl 、 1% Trholate、0.1% SDS 以及 sodium orthovanadate、E蛋白降解；②PMSF(100 mM, Phenylmethanesul蛋白酶抑制劑，，工作濃度為 1mM。按照以下步 RIPA 裂解液，輕搖混勻。取適量的裂解液， PMSF 的最終濃度為 1mM（通常 6 孔板每孔細胞密度非常高時可以適當加大裂解液的用量

單因素方差分析比較組內的平均值，并使用獨立樣本 t 檢驗方法分析軟件為 SPSS Statistics ver 22.0，其中 P <0.05 表示具有顯著標記。所有實驗數(shù)據(jù)至少重復三次。分析軟件熒光圖片處理軟件采用 Image-Pro Plus 5.0；細胞流式分析軟7.6；數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析軟件采用 IBM SPSS Statistics 22；統(tǒng)計學圖制作 GraphPad Prism 7；圖片處理軟件采用 Adobe Photoshop C果常培養(yǎng)條件下 2 株 hiPSCs 的鏡下觀察 1.1 所示，在 TeSR-E8TM和 mTeSRTM1 兩種完全培養(yǎng)基中，正常Cs 聚集在一起形成緊湊的多細胞集落，這些集落都具有明顯的邊鏡下可觀察到成簇的明亮細胞，且細胞排列緊密；
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 蘇競梅;;生殖衰老的生育困境(下)[J];人人健康;2017年09期

2 ;全球首例血液與大腦屏障建模成功[J];大眾科學;2017年05期

3 王皓帆;;抑制p53-p21通路誘導多能干細胞的生成[J];中國病理生理雜志;2010年01期

4 曹尚濤;余勝勇;李東偉;Jing Ye;Xuejie Yang;Chen Li;Xiaoshan Wang;Yuanbang Mai;Yue Qin;Jian Wu;Jiangping He;Chunhua Zhou;He Liu;Bentian Zhao;Xiaodong Shu;Chuman Wu;Ruiping Chen;Waiyee Chan;Guangjin Pan;Jiekai Chen;劉晶;裴端卿;;化學小分子誘導多能干細胞過程染色質可及性動態(tài)變化規(guī)律[J];科學新聞;2019年02期

5 王記;陸玉琴;徐鑫;紀召娟;;抑瘤素M促進小鼠誘導多能干細胞向心肌分化[J];基礎醫(yī)學與臨床;2017年10期

6 夏朦;侯偉健;柏樹令;敖強;;誘導多能干細胞的研究進展[J];中國民康醫(yī)學;2015年14期

7 溫玉琴;;研究發(fā)現(xiàn)誘導多能干細胞可用作癌癥疫苗[J];廣東藥科大學學報;2018年01期

8 ;用誘導多能干細胞能再生完整皮膚[J];廣州醫(yī)科大學學報;2016年02期

9 ;誘導多能干細胞機理與技術研究:躋身世界先進行列[J];廣東科技;2010年15期

10 李藝雯;鄒松;;為了中國科技人的光榮與夢想[J];國際人才交流;2019年12期

相關會議論文 前10條

1 王美婷;汪溪潔;;人誘導多能干細胞在藥物體外安全性評價中的應用[A];中國毒理學會第九次全國毒理學大會論文集[C];2019年

2 新浪綜合;;全球首例!用他人誘導多能干細胞治眼病[A];《科學與現(xiàn)代化》2018年第1期（總第074期）[C];2018年

3 嚴慶豐;;疾病特異性誘導多能干細胞研究[A];2015年浙江省醫(yī)學遺傳學學術年會暨高通量基因測序產(chǎn)前篩查與診斷技術研討會論文匯編[C];2015年

4 李錚;胡洪亮;李朋;郭熙志;劉平;張偉;張玲玲;史占平;田汝輝;黃翼然;;誘導多能干細胞經(jīng)體內外誘導向精子細胞分化研究[A];第十七屆全國泌尿外科學術會議論文匯編[C];2010年

5 蔣春艷;董娟;廖婷婷;寧松;薛志剛;崔毓桂;劉嘉茵;范國平;曾橋;;建立人誘導多能干細胞系及向神經(jīng)系統(tǒng)分化研究[A];中華醫(yī)學會第六次全國生殖醫(yī)學學術會議�？痆C];2012年

6 蔣春艷;董娟;廖婷婷;寧松;范國平;曾橋;薛志剛;崔毓桂;劉嘉茵;;建立人誘導多能干細胞系及向神經(jīng)系統(tǒng)分化研究[A];中華醫(yī)學會第八次全國計劃生育學術會議論文匯編[C];2012年

7 孫玉華;趙熒暉;任曉帥;鄧怡;徐安秀;魏世成;;多肽修飾紫外交聯(lián)甲基丙烯酸化透明質酸膜培養(yǎng)人誘導多能干細胞[A];第八屆全國口腔材料學術交流會暨中華口腔醫(yī)學會口腔材料專業(yè)委員會2013年會論文集[C];2013年

8 崔笑笑;崔亞洲;時良;欒靜;周小艷;韓金祥;;誘導多能干細胞到破骨細胞分化的探索[A];第八屆泛環(huán)渤海生物化學與分子生物學會2018年學術交流會論文集[C];2018年

9 李朋;楊施;胡洪亮;田汝輝;朱勇;馬猛;黃翼然;何祖平;李錚;郭熙志;;誘導多能干細胞體外培養(yǎng)與重構生精小管誘導精子發(fā)生機制研究[A];中華醫(yī)學會第六次全國生殖醫(yī)學學術會議�？痆C];2012年

10 齊自娟;崔亞洲;時良;欒靜;周小艷;韓金祥;;誘導多能干細胞鑒定中啟動子甲基化實驗條件探索[A];2017第七屆泛環(huán)渤海生物化學與分子生物學會學術交流會論文集[C];2017年

相關重要報紙文章 前10條

1 李潔尉　韓青海 朱丹萍;尿液是誘導多能干細胞理想來源[N];科學時報;2011年

2 記者 李潔尉　通訊員 朱丹萍;體細胞“變身”障礙破解[N];科學時報;2011年

3 本報記者 劉霞;誘導多能干細胞治心臟病，希望還是隱憂？[N];科技日報;2018年

4 記者 陳超 劉霞;全球首例!用他人誘導多能干細胞治眼病[N];科技日報;2017年

5 記者 范建;我科學家發(fā)現(xiàn)一個基因影響誘導多能干細胞質量[N];科技日報;2014年

6 杞人　朝勝;我科學家將誘導多能干細胞轉化效率提高到10%[N];科技日報;2009年

7 本報記者 汪立樂;首例“超級供體”誘導多能干細胞株“安徽造”[N];中國產(chǎn)經(jīng)新聞;2018年

8 記者 華義;用誘導多能干細胞能再生完整皮膚[N];科技日報;2016年

9 記者 張建列 通訊員 黃博純;為高效獲得誘導多能干細胞提供新思路[N];廣東科技報;2016年

10 記者 白毅;人誘導多能干細胞構建再生牙齒獲成功[N];中國醫(yī)藥報;2013年

相關博士學位論文 前10條

1 華永泉;葉酸多肽水凝膠聯(lián)合誘導多能干細胞移植治療小鼠心肌梗死的作用及機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

2 秦鼎新;腫瘤細胞來源的誘導多能干細胞研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2010年

3 薛燕婷;尿液分離細胞來源非整合人誘導多能干細胞庫的建立[D];中國科學技術大學;2013年

4 邸科前;小鼠雌性誘導多能性干細胞的分離與多能性研究[D];河北農業(yè)大學;2015年

5 劉鍇;建立安全有效的豬的誘導多能干細胞[D];南開大學;2014年

6 劉靜馨;癲癇病人誘導多能干細胞來源的神經(jīng)元中Nav1.1突變效應及其致病機理研究[D];中國科學技術大學;2016年

7 張高川;誘導多能干細胞和腫瘤干細胞中致瘤基因的生物信息學分析[D];蘇州大學;2014年

8 鄧彥飛;水牛誘導多能干細胞的研究[D];廣西大學;2012年

9 史慧君;高效制備綿羊誘導多能干細胞的研究[D];石河子大學;2015年

10 劉日淵;經(jīng)腰椎穿刺注射干細胞內耳移植新途徑的探索研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

相關碩士學位論文 前10條

1 高敦芹;誘導多能干細胞來源小胞外囊泡提取方法的建立及優(yōu)化[D];天津醫(yī)科大學;2019年

2 郎正鵬;人誘導多能干細胞的構建及向血管平滑肌細胞誘導分化的實驗研究[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

3 王旭東;人誘導多能干細胞系的建立[D];內蒙古大學;2019年

4 吳軒;基于人源誘導多能干細胞構建三維神經(jīng)網(wǎng)絡的研究[D];江漢大學;2019年

5 齊自娟;苯丙酮尿癥尿液來源非整合誘導多能干細胞建系及擬胚體成骨分化[D];濟南大學;2018年

6 付尚峰;燒傷患者特異性非整合誘導多能干細胞的建立與鑒定[D];南昌大學;2018年

7 劉益;建立人外周血單個核細胞來源的誘導多能干細胞[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

8 崔思穎;杜氏肌營養(yǎng)不良患胎絨毛來源非整合誘導多能干細胞的建立與鑒定[D];鄭州大學;2018年

9 趙霞;血管內皮生長因子對誘導多能干細胞向心肌細胞分化的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

10 殷欣;誘導多能干細胞轉錄因子在肝細胞癌復發(fā)及轉移的作用研究[D];復旦大學;2011年

本文編號：2594372