發(fā)布時間：2020-03-22 03:04

【摘要】：研究目的:近年來已有大量研究證明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hi PSCs)來源的小胞外囊泡(s EVs)(hi PSCs-s EVs)在各類疾病中發(fā)揮治療作用,然而目前對于s EVs來源供體細(xì)胞的收集培養(yǎng)上清時所用培養(yǎng)液條件及細(xì)胞狀態(tài)并沒有明確的報道,因此本文研究的目的是探索在提取hi PSCs-s EVs時,hi PSCs的培養(yǎng)條件及其能否維持細(xì)胞的正常狀態(tài),以確保在減少外來物質(zhì)對s EVs干擾的同時提取具有生物學(xué)活性的s EVs。1、根據(jù)hi PSCs的生長及分化狀態(tài)確定收集培養(yǎng)上清時所需條件培養(yǎng)基的組成;2、進一步確定可收集培養(yǎng)上清的天數(shù);3、改良s EVs的提取方法提取hi PSCs來源的s EVs;4、通過檢測形態(tài)、大小等驗證提取的s EVs的物理學(xué)特性;5、驗證s EVs表面標(biāo)志蛋白的表達(dá);6、利用Hep G2細(xì)胞證明提取的s EVs的生物學(xué)活性。研究方法:1、利用連續(xù)16h超速離心法制備去除細(xì)胞外囊泡的血清替代物(KSR)(ED-KSR);2、配制含有不同濃度(0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%)ED-KSR的條件培養(yǎng)基(CM);3、hi PSCs生長至一定密度后更換不同濃度CM,24h后利用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測不同濃度CM中細(xì)胞的生存率,BCA和SDS-PAGE分別測定不同濃度CM中提取出的s EVs蛋白濃度以及條帶分布,并確定最適宜的ED-KSR濃度;4、在0.5%CM中連續(xù)收集培養(yǎng)上清5d,并利用流式細(xì)胞儀測定分別收集1d,3d,5d時hi PSCs的存活率,堿性磷酸酶染色(ALP)、干性標(biāo)志物OCT4、SEEA4和SOX2的免疫熒光染色、干性標(biāo)志物NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析檢測hi PSCs的多能性,確定收集培養(yǎng)上清的時間;5、采用改良的超速離心法(M-UC)和Exo-Quick試劑盒(EQ)提取s EVs,并利用透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析(NTA)、蛋白印跡(WB)驗證所提取的s EVs的大小、形態(tài)以及蛋白表達(dá);6、PKH67標(biāo)記s EVs,鑒定是否能被受體細(xì)胞Hep G2攝取;7、不同濃度的s EVs加入到Hep G2中,觀察其對受體細(xì)胞的作用。研究結(jié)果:更換0%、0.25%、0.5%、2%、5%和20%六種濃度ED-KSR配制的CM 24h后,相差顯微鏡下觀察兩株hi PSCs的形態(tài),發(fā)現(xiàn)與干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hi PSCs相比,0.5%、2%、5%和20%CM中的細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化,均呈特征性的未分化狀態(tài),且流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)分析顯示各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),然而,0%和0.25%CM中hi PSCs的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生輕微改變,并開始出現(xiàn)分化現(xiàn)象,細(xì)胞存活率也顯著低于對照組(P0.05);BCA結(jié)果顯示0.5%、2%、5%和20%CM中收集的來源于兩株hi PSCs的s EVs的蛋白濃度分別為4.36±0.53、7.5±2.0、10.2±1.2、14.99±1.12;4.36±0.54、7.14±0.68、10.67±1.84、13.63±0.06,各組間差異顯著(P0.05),且SDS-PAGE結(jié)果也顯示KSR中的蛋白對0.5%CM中提取的s EVs干擾最小,上述結(jié)果均表明0.5%ED-KSR為適宜的CM濃度;隨后在0.5%CM中連續(xù)收集培養(yǎng)上清5天后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)無明顯變化,且流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示hi PSCs的存活率有浮動,但數(shù)據(jù)分析顯示此差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);堿性磷酸酶染色、OCT4、SEEA4和SOX2的免疫熒光、NANOG、OCT4和SOX2的q RT-PCR分析結(jié)果均顯示hi PSCs在收集5天后仍表達(dá)hi PSCs多能性標(biāo)志,呈未分化狀態(tài);采用M-UC和EQ兩種方法提取s EVs,TEM結(jié)果顯示提取的s EVs均為50-200nm,橢圓形或圓形的雙層膜性小囊泡,NTA結(jié)果顯示兩種方法提取的s EVs大小分別為186.6±2.6 nm、167.5±2.0 nm,;Western Blotting結(jié)果顯示兩株hi PSCs細(xì)胞來源的s EVs表達(dá)標(biāo)記蛋白CD63,TSG101和HSP70,不表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白Calreticulin;另外,PKH67染色實驗表明,s EVs可被受體細(xì)胞Hep G2內(nèi)吞,并以顆粒形式聚集在細(xì)胞質(zhì)中,且達(dá)到一定濃度的s EVs可以促進細(xì)胞增殖。研究結(jié)論:在維持hi PSCs多能性及存活率的條件下,0.5%ED-KSR為收集hi PSCs培養(yǎng)上清時所用條件培養(yǎng)基的適宜濃度,并且可連續(xù)收集5天;M-UC和EQ兩種方法均可提取具有促進受體細(xì)胞增殖的生物活性的s EVs,為后續(xù)的功能研究提供基礎(chǔ)。
【圖文】：

12圖 1.1 小胞外囊泡（sEVs）的提取方法檢測RIPA 裂解液（Radio Immunoprecipitation Assaris (pH 7.4) 、 150mM NaCl 、 1% Trholate、0.1% SDS 以及 sodium orthovanadate、E蛋白降解；②PMSF(100 mM, Phenylmethanesul蛋白酶抑制劑，，工作濃度為 1mM。按照以下步 RIPA 裂解液，輕搖混勻。取適量的裂解液， PMSF 的最終濃度為 1mM（通常 6 孔板每孔細(xì)胞密度非常高時可以適當(dāng)加大裂解液的用量

單因素方差分析比較組內(nèi)的平均值，并使用獨立樣本 t 檢驗方法分析軟件為 SPSS Statistics ver 22.0，其中 P <0.05 表示具有顯著標(biāo)記。所有實驗數(shù)據(jù)至少重復(fù)三次。分析軟件熒光圖片處理軟件采用 Image-Pro Plus 5.0；細(xì)胞流式分析軟7.6；數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析軟件采用 IBM SPSS Statistics 22；統(tǒng)計學(xué)圖制作 GraphPad Prism 7；圖片處理軟件采用 Adobe Photoshop C果常培養(yǎng)條件下 2 株 hiPSCs 的鏡下觀察 1.1 所示，在 TeSR-E8TM和 mTeSRTM1 兩種完全培養(yǎng)基中，正常Cs 聚集在一起形成緊湊的多細(xì)胞集落，這些集落都具有明顯的邊鏡下可觀察到成簇的明亮細(xì)胞，且細(xì)胞排列緊密；
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

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本文編號：2594372