【摘要】：【背景】肝纖維化是肝臟對慢性肝損傷因素(如酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎等)應答的一種創(chuàng)傷修復反應,是反復持續(xù)性肝臟損傷刺激產(chǎn)生的共有病理改變,表現(xiàn)為胞外基質(zhì)合成與分解平衡紊亂。晚期肝纖維化發(fā)展為肝硬化,伴有結(jié)構(gòu)喪失、功能衰竭和危及生命的并發(fā)癥。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn),由病毒性肝炎造成肝纖維化或肝硬化的患者,在成功接受病毒性肝炎治療后,其肝纖維化甚至肝硬化發(fā)生了逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。在嚙齒類動物肝纖維化模型中的研究發(fā)現(xiàn),移除病原體、中斷發(fā)病原刺激下的肝纖維化也可以得到逆轉(zhuǎn)。因此,研究和了解肝纖維化逆轉(zhuǎn)的機制有利于發(fā)現(xiàn)新的針對肝纖維化的治療靶向。近年來研究發(fā)現(xiàn),免疫細胞是纖維化中的關(guān)鍵角色,它有對誘導損傷和促進修復施加影響的能力。肝星狀細胞(HSC)是參與肝纖維化過程中的最重要細胞,其自身活化和增殖及膠原合成增加是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié);在CCl_4和BDL誘發(fā)的大鼠肝纖維化模型中,HSC的減少可以顯著地減弱肝纖維化以及肝臟損傷。因此,減少活化的HSC數(shù)量是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。前期研究表明,脾臟來源的免疫細胞(巨噬細胞、T細胞)參與肝慢性纖維化病變進程,且在肝硬化病變后期,脾臟亦可以受到影響而發(fā)生脾臟腫大及脾功能亢進,提示肝-脾免疫存在復雜相互影響。纖維化進展過程中,脾臟切除可一定程度延緩肝臟纖維化的進程,并影響肝纖維化逆轉(zhuǎn),提示脾臟切除可能影響肝臟中活化的HSC,進而影響肝臟的纖維化修復過程,但脾臟究竟以何種方式,并如何影響HSC目前尚不清楚�！灸康摹刻接懫⑴K在肝纖維化進展及修復過程中對肝纖維化的影響及機制�！痉椒ā�1.實驗分組健康雄性C57小鼠,清潔級,體重15-20g,由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。全部動物均在同一實驗室按清潔級小鼠要求由專人飼養(yǎng),自由進食水。將25只小鼠隨機分成實驗組:切脾+繼續(xù)打CCl_4組(A組,n=5)、切脾+停止打CCl_4組(B組,n=5)、假手術(shù)+繼續(xù)打CCl_4組(C組,n=5)、假手術(shù)+停止打CCl_4組(D組,n=5);對照組:空白對照組(E組,n=5)。各組于造模6周后取材。水合氯醛腹腔注射麻醉,眼球取外周血,無菌條件下切開皮膚進入腹腔,留取左葉肝組織150mg以備提取蛋白及核酸;另外切取部分肝臟左葉,以4%多聚甲醛固定,用于HE染色、天狼猩紅染色及免疫組織化學法染色;再切取部分肝臟左葉,OCT包埋并置于液氮中快速冰凍后保存于-80℃冰箱中,用于免疫熒光染色。2.肝纖維化進展及修復過程的小鼠模型建立實驗組(A、B、C、D組)給予四氯化碳(CCl_4)油溶液腹腔注射(CCl_4:Corn Oil=1:4),空白對照組(E組)給予溶劑注射,每隔兩天注射一次,實驗組連續(xù)造模4W后A、B組給予脾切除處理,C、D組給予假手術(shù)處理。術(shù)后A、C組繼續(xù)注射CCl_4兩周,B、D組停止注射CCl_4兩周。六周時處死小鼠并取材肝臟標本進行相應檢測。3.數(shù)據(jù)采集及分析HE染色及天狼星紅染色法顯示肝纖維化程度,qPCR檢測纖維化相關(guān)基因表達變化,Western Blot檢測Ⅰ型膠原及αSMA蛋白表達水平。制備肝臟組織石蠟切片,β半乳糖苷酶染色試劑盒檢測肝星狀細胞衰老情況;制備肝臟組織冰凍切片,caspase3與Tunel免疫熒光檢測肝星狀細胞凋亡情況,p53免疫熒光檢測肝星狀細胞衰老狀況。制備肝、脾及血清單細胞懸液,流式細胞儀檢測單核巨噬細胞數(shù)目變化。轉(zhuǎn)錄組測序(RNAseq)檢測肝臟相關(guān)因子表達變化情況�！窘Y(jié)果】1.小鼠肝纖維化造模情況造模6周后,與對照組相比,實驗組(A、B、C、D組)可見不同程度的肝細胞壞死并出現(xiàn)肝纖維化。HE染色可見B、C組均出現(xiàn)明顯假小葉形成,且C組假小葉出現(xiàn)更多,更為明顯,幾乎看不到正常的肝臟組織,并伴有大量炎性細胞浸潤。與C組相比,A組肝纖維化程度明顯減輕;天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)A組較C組纖維條索明顯減少;與D組相比,B組肝纖維程度更為嚴重;qPCR結(jié)果顯示實驗組肝纖維化相關(guān)基因,包括αSMA、TGFβ、PDGFβ、TNFα等均出現(xiàn)顯著性上升,其中A、C組及B、D組變化趨勢與HE及天狼星紅染色結(jié)果一致。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),與C組相比,A組αSMA及Ⅰ型膠原蛋白表達明顯下降;與D組相比,B組αSMA及Ⅰ型膠原蛋白表達明顯升高,與之前實驗結(jié)果相符。2.肝星狀細胞的變化小鼠肝組織冰凍切片Caspase-3及Tunel分別與Desmin的免疫熒光雙標染色結(jié)果顯示,在造模4周后繼續(xù)注射CCl_4的A、C組中,切脾組(A組)較假手術(shù)組(C組)肝星狀細胞Caspase-3與Tunel表達顯著升高(p0.01);在造模4周后停止注射CCl_4的B、D組中,切脾組(B組)肝星狀細胞Caspase3與Tunel表達較假手術(shù)組(D組)顯著降低(p0.05);β半乳糖苷酶染色顯示,在造模4周后繼續(xù)注射CCl_4的A、C組中,切脾組(A組)肝星狀細胞β半乳糖苷酶表達較假手術(shù)組(C組)明顯升高;在停止注射CCl_4的B、D組中,切脾組(B組)肝星狀細胞β半乳糖苷酶表達較假手術(shù)組(D組)明顯降低。流式細胞術(shù)顯示C組較A組肝星狀細胞標記物VitaminA~+細胞占肝組織非實質(zhì)細胞數(shù)目的比例顯著升高(p0.001),D組較B組VitaminA~+細胞數(shù)目顯著降低(p0.05)。3.肝纖維化組織中外來巨噬細胞數(shù)目變化流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與假手術(shù)繼續(xù)打CCl_4組(C組)相比,切脾繼續(xù)打CCl_4組(A組)小鼠肝組織中外來巨噬細胞(F4/80~(low)CD11b~(high))數(shù)目占非實質(zhì)細胞數(shù)目的比例顯著降低(p0.05);與之相反,切脾停止打CCl_4組(B組)較假手術(shù)停止打CCl_4組(D組)外來巨噬細胞(F4/80~(low)CD11b~(high))占非實質(zhì)細胞數(shù)目的比例有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異�！窘Y(jié)論】1.CCl_4小鼠肝纖維化模型中,造模4周后停止注射CCl_42周,纖維化明顯逆轉(zhuǎn)。肝纖維化進展時切脾導致纖維化程度減輕;肝纖維化修復過程中,切脾使纖維化程度加重。2.造模4周后停止打CCl_4的小鼠肝纖維化修復模型中,脾臟可能促進活化的肝星狀細胞凋亡及衰老。3.CCl_4造模小鼠肝纖維化進展與修復過程中,從脾臟遷移到肝臟內(nèi)的巨噬細胞可能影響活化肝星狀細胞的衰老與凋亡,進而影響肝纖維化。
【學位授予單位】：延安大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2;R-332

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本文編號：2594034