【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒感染引起的全球范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患病,患者發(fā)病后病死率接近于100%�？袢《靖腥竞笙仍诰植考∪饨M織中復(fù)制和擴(kuò)散,然后迅速沿末梢神經(jīng)和神經(jīng)周?chē)g歇的體液上行進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),上行過(guò)程中病毒在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中大量復(fù)制。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)被內(nèi)皮細(xì)胞緊密包裹,中和抗體,補(bǔ)體蛋白等特異性免疫應(yīng)答成分難以進(jìn)入其中發(fā)揮作用,而且其中缺乏巨噬細(xì)胞,炎性因子等非特異性免疫應(yīng)答成分。因此,一旦病毒進(jìn)入中樞神經(jīng),即便機(jī)體產(chǎn)生了高滴度的中和抗體也不能為機(jī)體提供有效保護(hù)。目前廣泛使用的無(wú)佐劑狂犬病疫苗往往要到14 DPI(day post inoculation)才能達(dá)到100%的陽(yáng)轉(zhuǎn)率,而在上世紀(jì)使用的鋁佐劑狂犬病疫苗要到42 DPI才能達(dá)到100%的陽(yáng)轉(zhuǎn)率。探索能夠激發(fā)機(jī)體快速或者持久產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答的佐劑對(duì)于狂犬病的防控至關(guān)重要。本研究將狂犬病疫苗毒株CTN-1-D15接種到人胚肺二倍體細(xì)胞中培養(yǎng)制備抗原。然后通過(guò)細(xì)胞ELISA方法檢測(cè)抗狂犬病毒抗體以篩選佐劑成分,發(fā)現(xiàn)100 μ g/mL紫杉醇在3 DPI抗體滴度0D平均值為0.717,采用方差分析發(fā)現(xiàn):它與其它佐劑成分實(shí)驗(yàn)組之間差異顯著(p0.01),表明紫杉醇具有快速刺激抗體的能力;MF59在14 DPI使抗體滴度0D平均值為0.945,與無(wú)佐劑組(0D平均值為0.493)比較其差異顯著(p0.01),說(shuō)明它能刺激機(jī)體高水平中和抗體的產(chǎn)生。鑒于紫杉醇和MF59具有細(xì)胞毒性和過(guò)敏反應(yīng)及持久性差的問(wèn)題,本研究將二者聯(lián)合以降低它們的使用濃度;另外輔酶Q10能夠穩(wěn)定細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性,它不但有利于三羧酸循環(huán)代謝而且利于線粒體驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。配制時(shí)采用角鯊烯萃取混懸液中的輔酶Q10,再按照體積比(5.0%角鯊烯;0.5%吐溫;0.5%司班)混勻后分散在琥珀酸-檸檬酸鈉緩沖液中,然后在800psi條件下通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)使其達(dá)到水包油(O/W)的狀態(tài),再用0.01 M的PBS稀釋1倍后加入20 μg/mL的紫杉醇制備而成,因其制備環(huán)節(jié)呈金黃色故命名為Golden05。將狂犬病Golden05佐劑疫苗分別在第0,3和7天對(duì)ICR小鼠進(jìn)行肌肉免疫。然后用快速免疫熒光抑制灶試驗(yàn)(RFFIT)監(jiān)測(cè)小鼠血清中和抗體滴度變化趨勢(shì),發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在5 DPI時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生有效的中和保護(hù)抗體(0.83 IU/mL),當(dāng)完成三針注射后的28 DPI時(shí),抗體水平達(dá)到2.86 IU/mL,連續(xù)監(jiān)測(cè)至免疫后第3個(gè)月,抗體均能夠維持在較高水平(2.05 IU/mL)。并在14 DPI時(shí),使用狂犬病標(biāo)準(zhǔn)攻毒株CVS-11對(duì)免疫后小鼠進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn),結(jié)果顯示狂犬病Golden05佐劑疫苗的保護(hù)效果達(dá)到100%。分析其免疫學(xué)機(jī)制發(fā)現(xiàn)Golden05能顯著提高體內(nèi)細(xì)胞線粒體的SDH活性,并能夠提高機(jī)體IFN-γ,TNF等前炎性因子的表達(dá),產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答;同時(shí)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的大量增殖,從而使?jié){細(xì)胞活化,能快速大量地產(chǎn)生中和抗體,激活特異性免疫應(yīng)答。并在物理化學(xué)和動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)中,Golden05具有良好的穩(wěn)定性和安全性。本研究通過(guò)維持細(xì)胞SDH活性,改良MF59并聯(lián)合紫杉醇制備的復(fù)合乳佐劑能夠快速且持久地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病毒特異性和非特異性的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
【圖文】：

？邋ｉ一＾一＾４邋一７咖值ｑ邋４．５邐ｆ邐＾逡逑Ｔ３邐４逡逑ｇ邋３．５逡逑Ｍ邐ｚｉ逡逑？邐２５邐邐１逡逑§邐Ｊｎ—邐邐邐邐邐邐邐ＯＤ邋值逡逑ｆ邋0５逡逑韌邐0邋１邐２邐３邐４邐５逡逑四個(gè)不同的批次逡逑圖１．邋１．四批次病毒原液使用兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１．邋Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｂａｔｃｈｅｓ邋ｏｆ邋ｒａｂｉｅｓ邋ｖｉｒｕｓ邋ｂｙ邋ｔｗｏ邋ｍｅｔｈｏｄｓ．逡逑如果將兩種檢測(cè)方法分別與其對(duì)應(yīng)的病毒滴度進(jìn)行分析，首先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，繪逡逑制線形相關(guān)散點(diǎn)圖（圖１．邋２）顯示其線性回歸擬合直線方程為ｙ＝３．邋２２３２ｘ邋－邋０．邋７８５４，逡逑Ｒ２＝０．邋９７９３，同時(shí)ｔ檢驗(yàn)結(jié)果為１．邋７６５，邋ｐ〈０．邋０１，均表明兩種對(duì)活病毒滴度檢測(cè)方法逡逑之間的線性關(guān)系具有顯著的意義。逡逑

培養(yǎng)條件邐條件的梯度設(shè)置逡逑接種量邐１％邐２％邐３％邐４％邐５％逡逑胞齡邐２４ｈ邐４８ｈ邐７２ｈ邐９６ｈ逡逑帶毒傳細(xì)胞比例邐１：２邐１：４邐１：８逡逑培養(yǎng)溫度邋３３°Ｃ邐３５邋°Ｃ邐３７邋°Ｃ逡逑血清濃度邐２％邐５％邐１０％逡逑基礎(chǔ)培養(yǎng)基邐ＭＥＭ邐ＤＭＥＭ邐１６４０邐ＭＥＭ／ＤＭＥＭ逡逑ｐＨ邋值邐６．８邐７．０邐１．２邐７．６邐７．８逡逑換液的體積邐５０％邐６０％邐７０％邐８０％邐９０％逡逑培養(yǎng)時(shí)間對(duì)狂犬病毒產(chǎn)量的影響：狂犬病毒吸附到敏感細(xì)胞需要至少３０邋ｍｉｎ，逡逑病毒復(fù)制周期一般１９－２４小時(shí)，最快為６小時(shí)，所以培養(yǎng)狂犬病毒的時(shí)間對(duì)于病毒逡逑產(chǎn)量具有影響，連續(xù)監(jiān)測(cè)１２，邋２４，，４８，，邋７２和９６小時(shí)后病毒收獲液的細(xì)胞ＥＬＩＳＡ法的逡逑０Ｄ值的變化見(jiàn)圖１．邋３。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)病毒從１２到７２小時(shí)，病毒滴度隨著培養(yǎng)時(shí)間逡逑的延長(zhǎng)而增加，到７２小時(shí)達(dá)到相對(duì)峰值，如果繼續(xù)培養(yǎng)到９６小時(shí)，０Ｄ值依然會(huì)得逡逑到升高，但是獲得的收益和時(shí)間成本比較起來(lái)，獲益有限。所以，狂犬病毒培養(yǎng)時(shí)逡逑間為７２小時(shí)后收毒適宜。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392-33

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本文編號(hào)：2594016