發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 16:43

【摘要】：背景和目的新生隱球菌(C.neoformans)是一種重要的導(dǎo)致系統(tǒng)感染條件致病真菌,在環(huán)境中廣泛存在,主要侵犯器官移植、AIDS、細(xì)胞毒藥物化療等長(zhǎng)期應(yīng)用等造成的免疫缺陷患者,此外也可感染免疫功能正常人,主要引起致命性的腦膜腦炎,感染死亡率非常高,而且這種感染容易造成慢性化或潛伏感染狀態(tài)。新生隱球菌主要的致病因素為產(chǎn)黑素、莢膜、外分泌酶的毒性作用及其在宿主體溫環(huán)境下生長(zhǎng)的能力等。C.neoformans是專性需氧的致病酵母菌,在實(shí)驗(yàn)室條件下,新生隱球菌在大氣氧濃度(21%)條件下生長(zhǎng)最佳。吸入C.neoformans后可通過(guò)血液播散到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致致命性的腦膜腦炎。眾所周知,人腦組織的氧濃度明顯低于大氣氧含量(21%),并且不同的解剖部位也不同。此外,炎癥、血栓形成以及感染相關(guān)的壞死也導(dǎo)致組織氧含量下降。因此,Cneoformans在致病過(guò)程中必須面對(duì)并適應(yīng)宿主組織氧含量的變化。國(guó)內(nèi)外最新研究認(rèn)為C.neoformans這種專性需氧致病酵母菌可以適應(yīng)缺氧環(huán)境并生存,并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)在于調(diào)整其復(fù)制速率以適應(yīng)相應(yīng)的氧含量的變化,并描述了C.neoforman 兩種可能感應(yīng)缺氧的途徑,即SREBP(甾醇調(diào)節(jié)因子連接蛋白家族)和Tco1途徑,但缺氧適應(yīng)對(duì)C.neoformans毒性因子的影響尚未被關(guān)注。我們前期研究中新生隱球菌在低氧條件下其毒力因子莢膜、黑素、磷脂酶尿素酶等表型較正常氧條件下變化明顯,但其具體機(jī)制并不清楚,并且低氧對(duì)新生隱球菌慢性潛伏感染的影響機(jī)制尚不清楚。黑素是新生隱球菌重要的致病因素之一,黑素不僅可保護(hù)隱球菌免受外界破壞,而且是重要的致病因子,并且還具有調(diào)節(jié)免疫功能。新生隱球菌通過(guò)漆酶將L-DOPA轉(zhuǎn)換成了多巴醌,添加氨基后形成了環(huán)多巴。氧化的環(huán)多巴轉(zhuǎn)換成了多巴色素,多巴色素互變異構(gòu)后形成了二羥吲哚,最后其自由聚合后形成了黑色素(帶負(fù)電荷的色素)。新生隱球菌漆酶有兩種基因編碼:LAC1和LAC2。Lac1是黑色素合成的重要作用酶。因此對(duì)漆酶的研究至關(guān)重要。但是,由于天然本體菌株產(chǎn)生的漆酶量少,不易純化等,因此,建立大量重組表達(dá)純化并且具有活性的漆酶異源表達(dá)系統(tǒng)至關(guān)重要。近年來(lái),越來(lái)越多的不同來(lái)源的漆酶基因被克隆,并在不同宿主中異源表達(dá),但是大部分屬于植物真菌,而對(duì)人類致病的重要病原真菌的漆酶蛋白的異源表達(dá)尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。因此本實(shí)驗(yàn)擬建立新生隱球菌漆酶的異源表達(dá)系統(tǒng),為進(jìn)一步研究漆酶的性質(zhì)等奠定基礎(chǔ)。綜上所述,本文的目的是1)探討低氧對(duì)新生隱球菌轉(zhuǎn)錄組尤其是重要毒力因子黑素、莢膜等的影響,以期對(duì)新生隱球菌慢性潛伏感染的機(jī)制研究提供思路;2)在原核、真核及昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)新生隱球菌漆酶重組蛋白;3)對(duì)新生隱球菌漆酶重組蛋白進(jìn)行純化及活性研究,為后續(xù)漆酶晶體結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)。方法1)低氧和正常氧條件下培養(yǎng)新生隱球菌,進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序分析,研究低氧對(duì)隱球菌菌株轉(zhuǎn)錄組的影響。2)利用全基因合成并優(yōu)化密碼子合成新生隱球菌漆酶基因,構(gòu)建到大腸桿菌、畢赤酵母表達(dá)菌株以及昆蟲細(xì)胞sf9細(xì)胞,并通過(guò)嘗試不同溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度以及培養(yǎng)時(shí)間等探討新生隱球菌漆酶在原核、真核和昆蟲系統(tǒng)中的表達(dá)情況。3)根據(jù)上述表達(dá)情況,探討不同組合方法對(duì)新生隱球菌漆酶重組蛋白進(jìn)行純化并檢測(cè)其活性。結(jié)果1)低氧條件下有316個(gè)基因表達(dá)存在差異,其中212個(gè)基因表達(dá)上調(diào),104個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。常氧培養(yǎng)組,與Oh相比,有519個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化,其中368個(gè)基因表達(dá)上調(diào),151個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。Cap59、Caap10、Cap64、Lac1和Ura5基因在兩種培養(yǎng)條件下,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均無(wú)差異。其他新生隱球菌毒力相關(guān)新基因表達(dá)也發(fā)生了不同變化。2)新生隱球菌漆酶重組蛋白可在原核細(xì)胞大腸桿菌中成功表達(dá),在37℃和16℃條件下,O.1mM、0.5mM、ImMIPTG濃度誘導(dǎo)下,大部分以包涵體形式表達(dá)。而在真核系統(tǒng)畢赤酵母中,未能成功表達(dá)。在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中,新生隱球菌漆酶重組蛋白以分泌蛋白形式可溶表達(dá)。3)新生隱球菌漆酶重組蛋白包涵體表達(dá)可以通過(guò)變復(fù)性方法,Q柱、Gel Filtration,Mono Q柱方法純化得到純度90%以上的蛋白。在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白,可經(jīng)過(guò)NI-NTA方法進(jìn)行純化得到高純度活性蛋白。結(jié)論低氧條件下新生隱球菌轉(zhuǎn)錄組發(fā)生變化,主要毒力相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化,不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)有所差異。通過(guò)優(yōu)化后全合成新生隱球菌Lac1基因并克隆至大腸桿菌BL21,該原核系統(tǒng)可成功大量表達(dá)新生隱球菌漆酶蛋白,并大部分以包涵體形式存在。通過(guò)Q柱等方法可純化新生隱球菌重組漆酶蛋白,純度可達(dá)90%以上。在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中,新生隱球菌漆酶蛋白以可溶形式分泌表達(dá),并經(jīng)過(guò)NI-NTA純化得到高純度活性蛋白。綜上,新生隱球菌漆酶的外源成功表達(dá)與純化可為后續(xù)研究如漆酶晶體結(jié)構(gòu)解析提供基礎(chǔ),可能為新生隱球菌致病機(jī)制的研究提供新思路。
【圖文】：

于脲酶所致的氨的生成和／或ｐＨ的升高。在體外，追蹤一個(gè)暴露于野生型或ｕｒｅｌ突變型真菌逡逑的ＨＢＭＥＣ細(xì)胞的緊密連接標(biāo)記物（ＺＯ－１）發(fā)現(xiàn)，突變的真菌解除連接的能力較弱。逡逑２．４多糖莢膜逡逑通過(guò)早前的真菌分離研宄，包裹隱球菌的胞外莢膜很早為人們所關(guān)注［５２］。但是多年后逡逑才由Ｂｅｎｈａｍ［５３］提出了這個(gè)結(jié)構(gòu)在致病中發(fā)揮重要作用。從一個(gè)從結(jié)構(gòu)和功能很少被關(guān)注的逡逑結(jié)構(gòu)，隱球菌莢膜已經(jīng)是目前最重要且最廣為研宄的隱球菌毒力因子。盡管如此，隱球菌莢逡逑膜的合成、結(jié)構(gòu)和功能仍有許多未知之處。研究多糖莢膜最初是通過(guò)紙色譜分析法，，確定了逡逑甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的存在［５４］。之后的研宄還發(fā)現(xiàn)多糖莢膜可以通過(guò)與兔逡逑子超免疫血清反應(yīng)進(jìn)行隱球菌血清分型［５５］。Ｒｅｂｅｒｓ［５６］發(fā)現(xiàn)隱球菌莢膜多糖可分為兩個(gè)部逡逑分。之后，Ｂａｔａｃｈａｉｊｅｅ和同事［５７］發(fā)現(xiàn)純化的莢膜多糖的較大的部分結(jié)構(gòu)并不包含半乳糖。逡逑研究者把這個(gè)多糖叫做ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｘｙｌｏｍａｎｎａｎ（ＧＸＭ）。而在１９８２年，Ｃｈｅｍｉａｋ［５８］發(fā)表文章首逡逑次描述了較小的那類含半乳糖的莢膜多糖，這部分結(jié)構(gòu)之后被命名為ｇａｌａｃｔｏｘｙｌｏｍａｎｎａｎ逡逑（ＧａｌＸＭ），然后又被重命名為ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｘｙｌｏｍａｎｎｏｇａｌａｃｔａｎ邋（ＧＸＭＧａｌ）。逡逑

這些位點(diǎn)都被證實(shí)與來(lái)源于ＣＮＬＡＣＩ邋ｃＤＮＡ的氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域一致。隱球菌漆酶逡逑的分子模型是基于Ｃｏｐｒｉｎｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓ漆酶的ｘ線數(shù)據(jù)構(gòu)成的，展示了四個(gè)銅中心結(jié)構(gòu)域的緊逡逑密結(jié)合（圖１．３邋ａ，ｂ）。純化的隱球菌漆酶通過(guò)高效液相色譜法和質(zhì)譜法測(cè)定，它可以催化多巴逡逑胺產(chǎn)生一種重要的黑色素中間產(chǎn)物多巴色素。該酶也表現(xiàn)出對(duì)兒茶酚胺的高度專一性，這個(gè)逡逑可能有助于親神經(jīng)性新生隱球菌的漆酶的優(yōu)化。逡逑（ａ）邐（的邐ｆ逡逑ＣＮＬＡＣＩ邐１１６邋ＬＨＷＨＧ邐Ｗ邋Ｗ邋Ｈ邋Ｓ邋Ｈ邋Ｙ邋１６５邐ｆ邐Ｍ逡逑ＣＮＬＡＣ２邐１１６邋Ｉ邋Ｈ邋Ｋ邋Ｒ邋Ｇ邐ＷＷＨＳＢＹ邋１６５邐＼邐ｖ邐／Ｂ－Ｊ邐＾逡逑Ｎ邋ｃｒａｓｓａ邐９４邋Ｉ邋Ｈ邋Ｎ邋Ｈ邋Ｇ邐ＷＹＨＳＨＦ邋１４３邐／邐）邋Ｊ邋Ｗ邋ＪＦ邋／逡逑Ｃ邋ｈｉｒｓｕｔｕｓ邋６９ＩＨＷＨＧ邐Ｆ邋Ｔ邋Ｈ邋Ｇ邋Ｈ邋Ｌ邋１１８邐，、邐Ｉ邐ＪＭ邋ｗ－逡逑ｂｃｐ．．．．．．備逡逑ＣＮＬＡＣＩ邐４８０邋ＨＰＹＨＬＨＧＮＥＦ邐＾Ｍｔｍ＼邋ＪＰ邋＾逡逑ＣＮＩＡＣ２邐４７７邋Ｈ邋Ｐ邋Ｙ邋Ｈ邋Ｉ邋Ｈ邋Ｇ邋Ｎ邋Ｅ邋Ｆ邐ｆ逡逑Ｎ邋ｃｒａｓｓａ邋４２８邋ＨＰＩＨＬＨＧＵＤＦ邐＾邋一ｙ邐ＴｊＭＰ１Ｖ＾ＬＺ，邋ｕ逡逑Ｃ邋ｈｉｒｓｕｔｕｓ邋４１６ＨＰＦＨＬＨＧＨＡＦ邐Ｓ邐＾邋／／逡逑Ｈｅｐ．邐９７９邋ＨＴＶＨＦＨＧＨＳＦ邐＜邐／＾［邋（■邋＼邋＾Ｋ－＇；逡逑…３＊邐ｔＸ邐ｆＡＡｉ逡逑ＣＮＬＡＣＩ邐５４３邐ＨＣＨＩＧＷＨＬＴＥＧ逡逑ＣＮＬＡＣ２邐５４０邐ＨＣＨＩＧＷＨＬＡＫＧ邐７邐＿逡逑Ｎ邋ｃｒａｓｓａ邋４９９邋ＨＣＫＶＡＷＫＶＳＧＧ邐＇邋）ｈ邋；、邋
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R379.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 司靜;李偉;崔寶凱;戴玉成;;真菌漆酶性質(zhì)、分子生物學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年02期

本文編號(hào)：2593628