【摘要】：目的:多形核嗜中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)又稱中性粒細胞,是人體血液循環(huán)中數(shù)量最多的一類白細胞,是防御細菌和真菌感染的第一道防線,在人體非特異性免疫反應中起著非常重要的作用。中性粒細胞是終末分化細胞,生命期限極短,僅24~48小時,并擁有能高效殺死病原體的強大毒性武器,但它們同樣能造成正常組織的損傷。因此,中性粒細胞的死亡必須被精確調(diào)控,這一任務主要是通過中性粒細胞自發(fā)程序性凋亡完成,且在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和炎癥消退中起重要作用。近年人們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在各種重要的生物學過程中發(fā)揮調(diào)控作用,擁有較長核酸鏈的非編碼RNA(lncRNA)可以通過結(jié)合特定序列的miRNA來調(diào)控編碼蛋白的mRNA表達,因此lncRNA被稱為miRNA海綿。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA作為競爭性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNAs,ceRNAs)可能與中性粒細胞凋亡密切相關(guān)。但其具體調(diào)控機制目前仍不十分清楚。本研究通過檢測中性粒細胞自發(fā)性凋亡過程中miRNA、lncRNA、mRNA的差異表達,使用生物信息學的方法構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA內(nèi)源競爭性RNA網(wǎng)絡,并分析獲得中性粒細胞自發(fā)性凋亡過程中的關(guān)鍵lncRNA。方法:(1)分離健康志愿者中性粒細胞,進行中性粒細胞(0小時,12小時,24小時)自發(fā)凋亡實驗;(2)分別抽提各時間點中性粒細胞的RNA;(3)運用miRNA芯片技術(shù)檢測并篩選出差異表達的miRNA;(4)從篩選出的差異表達的miRNA中選取4個(hsa-miR-487b、hsa-miR-4538、hsa-miR-4417和hsa-miR-4485)進行RT-PCR檢測,驗證芯片結(jié)果的可靠性;(5)檢索GEO,從GEO下載中性粒細胞mRNA和lncRNA時間序列的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)并篩選出差異表達的lncRNA和mRNA;(6)使用miRWalk、miranda和Targetscan預測差異表達miRNA的靶mRNA,使用miRWalk、RNAhybrid和Targetscan預測差異表達miRNA的靶l(wèi)ncRNA。(7)將差異表達lncRNA和差異表達mRNA分別與差異表達miRNA的靶l(wèi)ncRNA和mRNA合并取交集。得到miRNA-mRNA基因?qū)旌蚼iRNA-lncRNA基因?qū)臁?8)利用cytoscape軟件將miRNA-mRNA基因?qū)蚼iRNA-lncRNA基因?qū)?映射到互作網(wǎng)絡中,最終構(gòu)建lncRNA miRNA mRNA ceRNA互作網(wǎng)絡。(9)分析lncRNA miRNA mRNA互作網(wǎng)絡,篩選自發(fā)性凋亡過程中的關(guān)鍵lncRNA,并用RT-PCR驗證。結(jié)果:(1)miRNA芯片結(jié)果:以0小時組中性粒細胞為對照,選擇表達倍數(shù)2為上調(diào),表達倍數(shù)0.5的為下調(diào),miRNA芯片數(shù)據(jù)表明中性粒細胞自發(fā)性凋亡過程中一共有81個差異表達miRNA,其中上調(diào)表達的有49個,下調(diào)表達的有32個;在12小時組表達上調(diào)和下調(diào)的miRNA均有21個,24小時組表達上調(diào)和下調(diào)的miRNA分別有41個和22個。RT-PCR檢測上調(diào)表達的hsa-miR-487b和hsa-miR-4538的和下調(diào)表達的hsa-miR-4417和hsa-miR-4485,結(jié)果與芯片結(jié)果一致。(2)GSE37416 mRNA-lncRNA芯片數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果:以0 h組為對照,采用LIMMA分析,p值0.01和表達倍數(shù)2倍,篩選出中性粒細胞自發(fā)性凋亡過程中有176個差異表達lncRNA和1966個差異表達mRNA。(3)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡,用Cytoscape對其進行可視化,該網(wǎng)絡由117個lncRNA節(jié)點、671個mRNA節(jié)點、59個miRNA節(jié)點和3636條邊組成。(4)使用DAVID和BinGO分析ceRNA網(wǎng)絡中所有差異表達mRNA,高富集GO包括:I-kB激酶/NF-kB級聯(lián)的調(diào)控、細胞內(nèi)信號級聯(lián)和正向調(diào)控程序性細胞死亡等。KEGG通路分析顯示,8個通路明顯富集其中包括凋亡、toll樣受體信號通路和趨化因子信號通路等。(5)對lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡進行拓撲機構(gòu)分析,并構(gòu)建關(guān)鍵子網(wǎng)絡,篩選出3個以lncRNA(AC021016.2,LINC00909,TTN-AS1)為關(guān)鍵核心的子網(wǎng)絡,RT-PCR檢測3個lncRNA表達結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論:(1)獲得并分析了中性粒細胞自發(fā)性凋亡過程中的mRNA、lncRNA和miRNA差異表達譜。(2)基于ceRNA理論,首次構(gòu)建了一個中性粒細胞自發(fā)凋亡過程mRNA-miRNA-lncRNA內(nèi)源競爭性RNA網(wǎng)絡。(3)在mRNA-miRNA-lncRNA內(nèi)源競爭性RNA網(wǎng)絡中,篩選出3個以lncRNA為核心的子網(wǎng)絡,3個lncRNA(AC021016.2,LINC00909,TTN-AS1)可能通過調(diào)節(jié)miRNA的表達參與調(diào)節(jié)中性粒細胞自發(fā)性凋亡。本研究首次描繪了中性粒細胞凋亡過程中內(nèi)源競爭性RNA調(diào)控網(wǎng)絡,也篩選獲得了3個關(guān)鍵調(diào)控lncRNA,將為后續(xù)進行中性粒細胞自發(fā)性凋亡機制的研究提供新思路。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392.12

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本文編號：2592904