【摘要】：目的:多形核嗜中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)又稱中性粒細(xì)胞,是人體血液循環(huán)中數(shù)量最多的一類白細(xì)胞,是防御細(xì)菌和真菌感染的第一道防線,在人體非特異性免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用。中性粒細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,生命期限極短,僅24~48小時(shí),并擁有能高效殺死病原體的強(qiáng)大毒性武器,但它們同樣能造成正常組織的損傷。因此,中性粒細(xì)胞的死亡必須被精確調(diào)控,這一任務(wù)主要是通過中性粒細(xì)胞自發(fā)程序性凋亡完成,且在免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和炎癥消退中起重要作用。近年人們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在各種重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用,擁有較長(zhǎng)核酸鏈的非編碼RNA(lncRNA)可以通過結(jié)合特定序列的miRNA來調(diào)控編碼蛋白的mRNA表達(dá),因此lncRNA被稱為miRNA海綿。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNAs,ceRNAs)可能與中性粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。但其具體調(diào)控機(jī)制目前仍不十分清楚。本研究通過檢測(cè)中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡過程中miRNA、lncRNA、mRNA的差異表達(dá),使用生物信息學(xué)的方法構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA網(wǎng)絡(luò),并分析獲得中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡過程中的關(guān)鍵lncRNA。方法:(1)分離健康志愿者中性粒細(xì)胞,進(jìn)行中性粒細(xì)胞(0小時(shí),12小時(shí),24小時(shí))自發(fā)凋亡實(shí)驗(yàn);(2)分別抽提各時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞的RNA;(3)運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)并篩選出差異表達(dá)的miRNA;(4)從篩選出的差異表達(dá)的miRNA中選取4個(gè)(hsa-miR-487b、hsa-miR-4538、hsa-miR-4417和hsa-miR-4485)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性;(5)檢索GEO,從GEO下載中性粒細(xì)胞mRNA和lncRNA時(shí)間序列的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)并篩選出差異表達(dá)的lncRNA和mRNA;(6)使用miRWalk、miranda和Targetscan預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶mRNA,使用miRWalk、RNAhybrid和Targetscan預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶l(wèi)ncRNA。(7)將差異表達(dá)lncRNA和差異表達(dá)mRNA分別與差異表達(dá)miRNA的靶l(wèi)ncRNA和mRNA合并取交集。得到miRNA-mRNA基因?qū)旌蚼iRNA-lncRNA基因?qū)臁?8)利用cytoscape軟件將miRNA-mRNA基因?qū)蚼iRNA-lncRNA基因?qū)?映射到互作網(wǎng)絡(luò)中,最終構(gòu)建lncRNA miRNA mRNA ceRNA互作網(wǎng)絡(luò)。(9)分析lncRNA miRNA mRNA互作網(wǎng)絡(luò),篩選自發(fā)性凋亡過程中的關(guān)鍵lncRNA,并用RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果:(1)miRNA芯片結(jié)果:以0小時(shí)組中性粒細(xì)胞為對(duì)照,選擇表達(dá)倍數(shù)2為上調(diào),表達(dá)倍數(shù)0.5的為下調(diào),miRNA芯片數(shù)據(jù)表明中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡過程中一共有81個(gè)差異表達(dá)miRNA,其中上調(diào)表達(dá)的有49個(gè),下調(diào)表達(dá)的有32個(gè);在12小時(shí)組表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的miRNA均有21個(gè),24小時(shí)組表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的miRNA分別有41個(gè)和22個(gè)。RT-PCR檢測(cè)上調(diào)表達(dá)的hsa-miR-487b和hsa-miR-4538的和下調(diào)表達(dá)的hsa-miR-4417和hsa-miR-4485,結(jié)果與芯片結(jié)果一致。(2)GSE37416 mRNA-lncRNA芯片數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果:以0 h組為對(duì)照,采用LIMMA分析,p值0.01和表達(dá)倍數(shù)2倍,篩選出中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡過程中有176個(gè)差異表達(dá)lncRNA和1966個(gè)差異表達(dá)mRNA。(3)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),用Cytoscape對(duì)其進(jìn)行可視化,該網(wǎng)絡(luò)由117個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、671個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)、59個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)和3636條邊組成。(4)使用DAVID和BinGO分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)中所有差異表達(dá)mRNA,高富集GO包括:I-kB激酶/NF-kB級(jí)聯(lián)的調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)和正向調(diào)控程序性細(xì)胞死亡等。KEGG通路分析顯示,8個(gè)通路明顯富集其中包括凋亡、toll樣受體信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路等。(5)對(duì)lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)錂C(jī)構(gòu)分析,并構(gòu)建關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò),篩選出3個(gè)以lncRNA(AC021016.2,LINC00909,TTN-AS1)為關(guān)鍵核心的子網(wǎng)絡(luò),RT-PCR檢測(cè)3個(gè)lncRNA表達(dá)結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。結(jié)論:(1)獲得并分析了中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡過程中的mRNA、lncRNA和miRNA差異表達(dá)譜。(2)基于ceRNA理論,首次構(gòu)建了一個(gè)中性粒細(xì)胞自發(fā)凋亡過程mRNA-miRNA-lncRNA內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA網(wǎng)絡(luò)。(3)在mRNA-miRNA-lncRNA內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA網(wǎng)絡(luò)中,篩選出3個(gè)以lncRNA為核心的子網(wǎng)絡(luò),3個(gè)lncRNA(AC021016.2,LINC00909,TTN-AS1)可能通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)參與調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡。本研究首次描繪了中性粒細(xì)胞凋亡過程中內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),也篩選獲得了3個(gè)關(guān)鍵調(diào)控lncRNA,將為后續(xù)進(jìn)行中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡機(jī)制的研究提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392.12

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本文編號(hào)：2592904