發(fā)布時間：2020-03-21 08:15

【摘要】：目的:對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)ΔA146Ply、SP0148及ΔA146Ply-SP0148進行克隆、表達及純化,將純化后的重組蛋白經(jīng)鼻腔黏膜免疫C57BL/6小鼠,進一步探討3種重組蛋白對D39型肺炎鏈球菌致死性感染的小鼠的保護效果,及其對19F型肺炎鏈球菌在小鼠鼻咽部及肺部定植的影響。本研究為后續(xù)ΔA146Ply-SP0148新型蛋白質(zhì)疫苗的研發(fā)提供實驗依據(jù)。方法:以PCR技術(shù)擴增ΔA146Ply、SP0148基因,通過基因合成技術(shù)獲得ΔA146Ply-SP0148基因。目的基因連接于pET28a(+)質(zhì)粒載體,將其轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達及Ni-NTA柱純化后,擬獲得高純度的ΔA146Ply、SP0148和ΔA146Ply-SP0148三種重組蛋白。將三種重組蛋白作為抗原經(jīng)鼻腔黏膜免疫C57BL/6小鼠,檢測血清中特異性抗體IgG和唾液中特異性抗體IgA的效價。采用D39型肺炎鏈球菌攻毒免疫小鼠并連續(xù)監(jiān)測小鼠21天的生存率,以評價重組蛋白對C57BL/6小鼠小鼠肺炎鏈球菌致死性感染的保護效果。最后采用19F型肺炎鏈球菌經(jīng)鼻腔滴注小鼠,并計數(shù)小鼠鼻腔灌洗液和肺組織勻漿中細菌的載量,以評價ΔA146Ply-SP0148融合蛋白對肺炎鏈球菌在小鼠鼻腔及肺組織定植的能力。結(jié)果:本研究成功構(gòu)建了ΔA146Ply、sp0148,以及ΔA146Ply-SP0148融合基因的pET28a(+)重組質(zhì)粒,并最終獲得純度80%的ΔA146Ply、SP0148及ΔA146Ply-SP0148三種重組蛋白。與CT佐劑組比較,△A146Ply組、SP0148組經(jīng)鼻腔滴注C57BL/6小鼠,其血清中均產(chǎn)生了高效價的IgG和IgA特異性抗體(均P0.01),且△A146Ply-SP0148組更能刺激小鼠產(chǎn)生極高效價的IgG和IgA特異性抗體(P0.001)。對小鼠致死性感染保護的效果評價提示,△A146Ply-SP0148融合蛋白對D39型肺炎鏈球菌經(jīng)黏膜途徑攻毒所致的小鼠致死性感染能夠產(chǎn)生很好的免疫保護效應(yīng)(與陽性對照PPV23組比較,P0.05)。與PPV23陽性對照組比較,△A146Ply-SP0148組的鼻腔灌洗液和肺組織勻漿中載菌量相對增高,但組間比較無明顯差異(P0.05)。以上結(jié)果提示,△A146Ply-SP0148重組蛋白能夠顯著降低19F型肺炎鏈球菌在鼻腔及肺部的定植能力。粘附抑制實驗結(jié)果證實,△A146Ply、SP0148、△A146Ply-SP0148重組蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的特異性抗血清能明顯抑制D39型S.pn粘附到A549細胞表面(均P0.01)�？贵w補體殺菌實驗證實,△A146Ply、SP0148、△A146Ply-SP0148刺激小鼠產(chǎn)生的特異性抗血清,其激活補體對S.pn的殺滅能力明顯高于Anti-CT組(均P0.01)。結(jié)論:△A146Ply-SP0148融合蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠對致死性肺炎鏈球菌感染的黏膜免疫應(yīng)答,且能夠顯著降低19F型肺炎鏈球菌在小鼠鼻咽部及肺部的定植。由于△A146Ply和SP0148均能誘發(fā)Th1和Th17型細胞免疫反應(yīng),提示△A146Ply-SP0148融合蛋白有望作為肺炎鏈球菌新的蛋白質(zhì)候選疫苗。
【圖文】：

圖 1 目的基因凝膠電泳圖Fig 1 Gel electrophoresis of target gene注：圖 1 A M: DNA Marker 2000 ; 1 泳道: △A146Ply 基因擴增產(chǎn)物; 圖 1B M: DNA Marker 2000 ; 1-: sp0148 基因擴增產(chǎn)物; 圖 1C M: DNAMarker 5000 ; 1-2 泳道:△A146Ply-sp148 基因合成產(chǎn)物.對 構(gòu) 建 成 功 的 pET-28a(+)-△A146Ply 、 pET-28a(+)-sp0148 和 pET-28A146Ply-sp0148 重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，，酶切產(chǎn)物采用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳見與目的基因大小相符的酶切片段(結(jié)果見圖 2) 。上述質(zhì)粒均送上海生工生物技司進行測序，測序結(jié)果證實其與預(yù)期相符，提示 3 種重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功(見圖

可見與目的基因大小相符的酶切片段(結(jié)果見圖 2) 。上述質(zhì)粒均送上海生工生物技術(shù)公司進行測序，測序結(jié)果證實其與預(yù)期相符，提示 3 種重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功(見圖 3）圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 2 The double enzyme digestion of recombinant plasmids.注: 圖2 A M: DNA Marker 5000; 1 泳道: pET-28a(+)-△A146Ply重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物; 2 完整pET-28a(+)-△A146Ply重組質(zhì)粒。圖2B M: DNA Marker 5000; 1 泳道: pET-28a(+)-sp0148重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物; 2 泳道: 完整pET-28a(+)-sp0148重組質(zhì)粒。圖2C M: DNA Marker 5000; 1 泳道: pET-28a(+)-△A146Ply-sp0148重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物; 2 泳道: 完整pET-28a(+)-△A146Ply-sp0148重組質(zhì)粒。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[J];泰州科技;2010年08期

2 李東巧;陳芳;Cynthia Liu;Yingzhu Li;Yi Deng;韓濤;余敏;楊艷萍;王學(xué)昭;;全球融合蛋白藥物研發(fā)態(tài)勢分析[J];中國生物工程雜志;2019年05期

3 KahYong Goh;Lufang Zhou;練桂麗;;線粒體融合蛋白與心血管疾病[J];中華高血壓雜志;2014年10期

4 徐富勇;孟瑋;劉仁榮;徐玲;裘雪梅;朱立鑫;;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇模擬表位的2種融合蛋白的表達及其在無毒酶聯(lián)免疫吸附方法中的應(yīng)用[J];食品科學(xué);2014年08期

5 李獻帥;穆軍升;;線粒體融合蛋白1、線粒體融合蛋白2與心肌細胞生理機能關(guān)系的研究進展[J];中國胸心血管外科臨床雜志;2013年04期

6 沈波;傅鷹;孟哲峰;徐巍;何小帆;朱敏;;融合蛋白CXCL10-loop3-EGF的可溶性表達及其抗腫瘤效應(yīng)研究[J];中國病理生理雜志;2009年12期

7 汪建華;融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2004年12期

8 楊和平，黃宗之;融合蛋白的生產(chǎn)技術(shù)[J];中國動脈硬化雜志;1994年04期

9 黃培堂;W.K.Maas;;表達具有熱穩(wěn)定腸毒素Ⅱ免疫原性融合蛋白菌株的構(gòu)建[J];生物工程學(xué)報;1988年04期

10 蔡仕英,馬賢凱;提純性融合蛋白[J];生物工程進展;1988年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 姜文國;張樹平;;基于4-1BBL的雙功能融合蛋白的構(gòu)建及比較[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

2 孫益;葛霽光;;人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和可溶性人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的融合蛋白的表達[A];中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第六次會員代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

3 高基民;呂建新;;白細胞介素15/鏈親和素融合蛋白的制備及活性測定[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

4 李鳳杰;張蓉;胡長鵬;冉茜;向陽;相麗欣;陳立;肖燕妮;李忠俊;;急性輻射損傷防治藥物制劑IL-12/Fc融合蛋白的藥效學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究[A];中國毒理學(xué)會第七次全國會員代表大會暨中國毒理學(xué)會第六次中青年學(xué)者科技論壇論文摘要[C];2018年

5 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的表達及其免疫原性[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第六次研討會論文集[C];2005年

6 楊振泉;劉巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的表達及其免疫原性[A];中國生物工程學(xué)會第四次會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2005年

7 王蘭;王德仲;楊晶;官麗莉;王艷芳;劉秀明;夏繼橋;李海燕;姜潮;李校X;;擬南芥表達植物油體蛋白-角質(zhì)細胞生長因子-2融合蛋白的研究[A];2013全國植物生物學(xué)大會論文集[C];2013年

8 陳麗華;王強;侯萬國;;不同鏈接劑修飾的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中國化學(xué)會第十二屆膠體與界面化學(xué)會議論文摘要集[C];2009年

9 丁來豐;王玉蘭;;一種融合蛋白對黑素瘤移植小鼠代謝組影響的研究[A];2018第二十屆全國波譜學(xué)學(xué)術(shù)年會會議論文摘要集[C];2018年

10 孫翠蓮;潘建平;;sflk1-IFN-γ融合蛋白的分離與純化[A];浙江省免疫學(xué)會第六次學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 曹麗君;新型抗流感藥物有望治療非典等病[N];新華每日電訊;2003年

2 通訊員 沈季 記者 張兆軍;抗腫瘤融合蛋白進入臨床試驗[N];科技日報;2005年

3 記者 朱敏麗　通訊員 潘越;中國醫(yī)藥城首批融合蛋白試劑出口[N];泰州日報;2010年

4 常麗君;線粒體融合蛋白2決定細胞生死[N];科技日報;2013年

5 吳紅梅;我省首批融合蛋白試劑出口美國[N];新華日報;2010年

6 金陵;融合蛋白試劑首次出口美國[N];中國醫(yī)藥報;2010年

7 本報特約撰稿 吳文君;抗體藥與融合蛋白藥物兩大高速擴容地帶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2016年

8 記者 張曄　通訊員 劉寧春;一種有效治療冠心病的融合蛋白發(fā)現(xiàn)[N];科技日報;2009年

9 毛磊;新型抗流感藥物有望面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

10 馮衛(wèi)東;抑制蛋白相互作用可成為治癌新方法[N];科技日報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 羅剛;畢赤酵母表達重組豬促卵泡素的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

2 吉福志;融合蛋白anti-EGFR-iRGD對胃癌放療增敏作用與機制[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

3 茹毅;重組HSA/dTMP融合蛋白在哺乳動物細胞中的高效表達及其活性研究[D];蘭州大學(xué);2016年

4 王梅竹;TAT-HSA-α-MSH融合蛋白的酵母表達及抑制中樞神經(jīng)炎癥的研究[D];蘭州大學(xué);2016年

5 殷艷婷;B類G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所);2017年

6 王維敏;長效Fc-apelin-13融合蛋白對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟及心臟的保護作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

7 王海波;m_4AchR-Gilα融合蛋白的表達及功能的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

8 蔣衛(wèi)民;HIV-1 p24和gp41融合基因載體的構(gòu)建以及融合蛋白在原核細胞中的表達[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

9 張意;酵母表達的MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的生物學(xué)功及其相關(guān)機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 王宣軍;BCG熱休克蛋白65-HER2多表位融合蛋白[D];吉林大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王阿香;anti-PD-1/IL-15/IL-15Rα雙功能融合蛋白的制備及其生物學(xué)功能研究[D];鄭州大學(xué);2019年

2 張素婷;融合蛋白ΔA146Ply-SP0148經(jīng)黏膜途徑免疫對小鼠肺炎鏈球菌感染的保護效應(yīng)研究[D];遵義醫(yī)科大學(xué);2019年

3 王娜;重組促血小板生成素模擬肽-人血清白蛋白融合蛋白的分離純化及穩(wěn)定性研究[D];蘭州大學(xué);2017年

4 汪坤;新蛭素與人IgG-Fc融合蛋白的表達純化和功能評價[D];天津大學(xué);2018年

5 趙東偉;人hAPRIL-Fc、hBAFF-Fc融合蛋白的原核高效表達、純化及功能鑒定[D];南京師范大學(xué);2015年

6 馬磊;家馬sAPRIL/Fc、sBAFF/Fc融合蛋白的高效表達、純化及生物活性檢測[D];南京師范大學(xué);2015年

7 周玲;預(yù)防宮頸癌的多價HPV L2疫苗的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

8 張小玉;GST-SRY融合蛋白原核表達和純化及組蛋白修飾在SOX9基因表達中的作用[D];大理大學(xué);2018年

9 胡雪麗;利用泛素融合蛋白研究DNMT1招募的分子機制[D];華東師范大學(xué);2018年

10 梁志穎;由正交融合蛋白激活的釀酒酵母合成啟動子庫的構(gòu)建[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2593048