【摘要】：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞于2006年在日本首次成功建立,是一種將高度分化的成熟體細(xì)胞通過誘導(dǎo)使其基因重編程的技術(shù)。最終細(xì)胞回歸到類似于胚胎干細(xì)胞擁有能夠自我更新復(fù)制以及強大分化潛能的多能干性的細(xì)胞狀態(tài)。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的應(yīng)用前景十分廣泛,可應(yīng)用于疾病模型、再生醫(yī)學(xué)及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。伴隨著發(fā)展,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在技術(shù)上也正在不斷進步和突破,從最初的整合基因法到相對安全可靠的非整合基因法,從依賴滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)方法到完全排除外源細(xì)胞干擾的無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方法,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)逐漸趨向簡單化、程序化。海弗利克極限理論指出了細(xì)胞的分裂次數(shù)是有限的,但在一些特殊條件的刺激下,細(xì)胞能夠逃脫此極限,從而達到永生化的狀態(tài)。永生化的細(xì)胞是一種處于正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的形態(tài),細(xì)胞能夠無限增殖,并且沒有惡化的表征。對永生化細(xì)胞的深入研究可幫助我們了解正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間生理及功能的變化,以及有助于探究細(xì)胞衰老的生理機制。永生化細(xì)胞也可作為一種人類遺傳資源進行收集,尤其是某些疾病特性基因,以活細(xì)胞的形式儲存起來,建立永生化細(xì)胞庫。本研究采用人外周血單個核細(xì)胞作為細(xì)胞來源,采樣便捷、安全,對人體的損傷小。以仙臺病毒作為載體,將承載著的4種胚胎干細(xì)胞特異表達的關(guān)鍵細(xì)胞因子,導(dǎo)入來源細(xì)胞中使其重編程,以此構(gòu)建誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系。在原代及傳代的培養(yǎng)中摒棄傳統(tǒng)的含外源細(xì)胞的滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法,以無滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的方法取代。同時,在來源細(xì)胞中提取微量的細(xì)胞,建永生化B淋巴細(xì)胞系。技術(shù)優(yōu)化后所建立的細(xì)胞系在經(jīng)過了培養(yǎng)、傳代及鑒定,最終實驗結(jié)果顯示:1、培養(yǎng)至第12天出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆團,第18天成為典型的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞間細(xì)胞間緊密接觸、無明顯間距,克隆團的邊緣清晰,形態(tài)與胚胎干細(xì)胞相似;2、細(xì)胞AP染色結(jié)果呈陽性,表明細(xì)胞重編程并回歸未分化的干細(xì)胞狀態(tài);3、免疫熒光檢測誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表面抗原Oct4與SSEA4呈陽性;4、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞三胚層分化鑒定成功,證明了細(xì)胞的分化潛能;5、永生化B淋巴細(xì)胞以聚團的形態(tài)生長,流式檢測CD19陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的89.92%。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與永生化B淋巴細(xì)胞建系方法的結(jié)合,充分利用了來源的細(xì)胞資源。永生化B淋巴細(xì)胞的收集,尤其是一些罕見的基因疾病細(xì)胞,可為日后細(xì)胞生理機制等科研探索提供遺傳資源的儲備。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞存在未來存在醫(yī)學(xué)應(yīng)用可能性,可填補永生化B淋巴細(xì)胞因細(xì)胞非正常而無法應(yīng)用于臨床的缺點。本文對技術(shù)細(xì)節(jié)的優(yōu)化提高了效率,節(jié)省了時間成本,操作步驟的簡化使未來細(xì)胞培養(yǎng)全自動化的可能性更進一步。
【圖文】：

in day 1. B: Growth of iPSCs in day 2. D: Growth of iPSCs me differentiated cells occurred in the culture process. Scale =性多能干細(xì)胞的 AP 染色鑒定同一視野下誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在 AP 染色結(jié)果，堿一種單酯磷酸水解酶，在具有全能干性的胚胎干細(xì)化后，AP 表達及活性便隨之降低（圖 2-3-D）。本酸酶呈陽性（圖-2-3-A 和 B），表明本實驗的誘導(dǎo)在未分化的干性細(xì)胞狀態(tài)�？瞻讓φ战M為不加指示），，陰性對照組采用成纖維細(xì)胞，由于纖維細(xì)胞為分-3-D）。由人外周血單個核細(xì)胞建立的誘導(dǎo)性多能干經(jīng)過重編程回歸到與胚胎干細(xì)胞相似的多能干細(xì)胞證實了這一過程。

圖2-4-B 和 D 顯示的藍色是細(xì)胞核，圖 2-4-C 和 F 是完整的合并圖�？瞻讓φ帐遣患覱ct4 與 SSEA4 抗體而直接進行二抗染色的 iPSCs。陰性對照組是成纖維細(xì)胞，由于細(xì)胞已分化，細(xì)胞不存在 Oct4 與 SSEA4 的表面抗原�？瞻讓φ战M與陰性對照組均不顯色。免疫熒光鑒定結(jié)果表明誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞表達了細(xì)胞因子Oct4與SSEA4。圖 2-4 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的熒光染色鑒定Figure 2-4 Fluorescence image of iPSCsA: Oct4 抗原顯色結(jié)果；B: 細(xì)胞核 DAPI 顯色結(jié)果；C: A 與 B 結(jié)果合并圖；D: SSEA4 顯色結(jié)果；E:細(xì)胞核 DAPI 顯色結(jié)果；F: D 與 E 結(jié)果合并圖。比例尺=200 μm。A: Fluorescence image of Oct4+ cells. B: DAPI for the nuclear. C: The combined diagram of A and B.
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2592132