【摘要】：目的第一部分:TBK1是干擾素β產(chǎn)生以及抗病毒天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。TBK1的修飾會(huì)影響抗病毒天然免疫反應(yīng)。明確WAZX2泛素連接酶對(duì)于TBK1的泛素化修飾作用,并且探究WAZX2在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用。第二部分:塞澤里綜合征是一種具有抗凋亡能力的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。最近研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SATB1在塞澤里綜合征中對(duì)抗凋亡的重要性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在某些條件下SNF5是SATB1的上游調(diào)節(jié)蛋白,并且二者在塞澤里綜合征細(xì)胞中都低表達(dá)。明確SNF5和SATB1在塞澤里綜合征中對(duì)其抗凋亡能力產(chǎn)生的影響。因此,設(shè)計(jì)SWI/SNF復(fù)合物為靶點(diǎn)的藥物可能會(huì)成為治療塞澤里綜合征的一個(gè)新思路。方法第一部分:1.通過帶有GFP熒光的VSV-Δ51病毒對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行感染,倒置顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)被感染HEK293T細(xì)胞GFP發(fā)光情況。2.通過仙臺(tái)病毒SeV感染HEK293T細(xì)胞,提取細(xì)胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,Real-time PCR檢測(cè)IFN-βmRNA水平情況。同時(shí)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)IFN-β啟動(dòng)子活性。3.用LPS刺激或VSV病毒感染iBMDM細(xì)胞,分別在4h、8h和12h收取細(xì)胞并提取RNA,檢測(cè)WAZX2 mRNA水平情況。4.通過熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RIG-I N、MAVS、TBK1、IKKi、IRF3 5D等接頭蛋白激活的信號(hào)后,WAZX2對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響。同時(shí),通過免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)WAZX2和接頭蛋白的相互作用。5.采用免疫共沉淀方法檢測(cè)WAZX2對(duì)TBK1泛素化水平修飾的改變以及泛素化修飾的類型。第二部分:1.通過基因芯片分析,研究SNF5表達(dá)缺失,對(duì)SATB1表達(dá)的影響。2.利用qRT-PCR和Western Blot的方法驗(yàn)證SNF5缺失表達(dá)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞以及淋巴瘤細(xì)胞中SATB1的表達(dá)情況。3.將SNF5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中,或者在T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中通過免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)相互作用。4.采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)SATB1在SNF5低表達(dá)的塞澤里綜合征細(xì)胞中的表達(dá)情況;同時(shí),在塞澤里綜合征細(xì)胞中恢復(fù)SATB1、SNF5的表達(dá),或者恢復(fù)SNF5表達(dá)的同時(shí)抑制SATB1的表達(dá),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況;Western Blot的方法觀察Caspase信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果第一部分:1.熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)帶有GFP熒光的293T細(xì)胞,在過表達(dá)WAZX2的情況下比對(duì)照組減少;并且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)帶有GFP熒光的HEK293T細(xì)胞也減少。利用siRNA抑制HEK293T細(xì)胞中WAZX2的表達(dá),則結(jié)果相反。2.SeV感染W(wǎng)AZX2過表達(dá)的HEK293T細(xì)胞后,IFN-βmRNA表達(dá)水平升高,并且熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)IFN-β的啟動(dòng)子活性增強(qiáng);siRNA抑制293T細(xì)胞中WAZX2表達(dá)后,結(jié)果相反。3.LPS刺激或VSV病毒感染iBMDM細(xì)胞后,wazx2 mRNA表達(dá)水平上升高。4.在RIG-I N、MDA5、MAVS、TBK1所激活的信號(hào)通路中,WAZX2對(duì)IFN-β的啟動(dòng)子活性都具有上調(diào)作用,但是對(duì)IKKi和IRF3 5D所引起的IFN-β的啟動(dòng)子活性無明顯改變;WAZX2缺失表達(dá)后結(jié)果相反。免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)外源的TBK1與外源的WAZX2存在相互作用。5.WAZX2使TBK1泛素化水平增加;WAZX2表達(dá)缺失后,結(jié)果相反。WAZX2增加了TBK1 K63位形式的泛素化。第二部分:1.基因芯片分析發(fā)現(xiàn),在SNF5表達(dá)缺失情況下,SATB1表達(dá)會(huì)下降。2.qRT-PCR和Western Blot的方法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SNF5缺失表達(dá)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞以及淋巴瘤細(xì)胞中SATB1的表達(dá)會(huì)隨之下調(diào)。3.通過比對(duì)人和酵母中SNF5和SATB1氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)人的SNF5與酵母中的序列相似度達(dá)到36%,而人的SATB1與酵母中的序列相似度達(dá)到26%;進(jìn)一步通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)在Hut78和HEK293T細(xì)胞系中SATB1與SNF5存在相互作用。4.在SNF5缺失的小鼠CD8~+T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞以及Hut78細(xì)胞中,SATB1在RNA水平呈現(xiàn)低表達(dá);在Hut78細(xì)胞中恢復(fù)SATB1、SNF5的表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抗凋亡能力減弱,被切割的Caspase8和Caspase3蛋白水平升高;當(dāng)恢復(fù)SNF5表達(dá)的同時(shí)抑制SATB1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的抗凋亡能力無明顯變化,被切割的Caspase8和Caspase3蛋白水平有所減少。結(jié)論第一部分:1.WAZX2對(duì)于HEK293T細(xì)胞的抗病毒能力起到了正向調(diào)控作用。2.WAZX2正向調(diào)控IFN-βmRNA水平表達(dá),并且正向調(diào)控IFN-β信號(hào)通路。3.巨噬細(xì)胞系中,在LPS的刺激下或者是VSV病毒的感染下會(huì)影響正向調(diào)節(jié)wazx2 mRNA水平的表達(dá)。4.在RIG-I N、MAVS、TBK1、IRF3 5D所激活的信號(hào)通路中,WAZX2對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性都具有正向調(diào)控的作用;并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中外源的WAZX2與TBK1存在相互作用。可見,TBK1很可能是WAZX2的靶分子。5.外源WAZX2使外源TBK1的泛素化增加,并且增加的是K63位形式的泛素化修飾。WAZX2可能是通過對(duì)TBK1增加K63位形式的泛素化,增強(qiáng)了TBK1的功能,最終正向調(diào)控了抗病毒天然免疫反應(yīng)。第二部分:1.在一些類型的細(xì)胞中,SWI/SNF復(fù)合物直接調(diào)節(jié)了SATB1的表達(dá)。2.在一些類型的細(xì)胞中,SNF5表達(dá)缺失導(dǎo)致SATB1的低表達(dá)。3.SATB1特異地與SNF5(或SWI/SNF復(fù)合物)相互作用。4.在塞澤里綜合征中,SNF5低表達(dá)可引起SATB1表達(dá)下調(diào),最終導(dǎo)致該疾病具有抗凋亡的能力。
【圖文】：

3圖 1，TLR，RLR 和 NLR 抗病毒蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的模式圖（JEM，2016 Vol.213, No.1）素對(duì)天然免疫信號(hào)通路調(diào)控白翻譯后修飾（PTMs）形成了精細(xì)的調(diào)節(jié)天然免疫信號(hào)通路的一修飾是其中關(guān)鍵的一種修飾。泛素化就是將一個(gè) 8.6KD 大小的泛 接 。 泛 素 化 修 飾 主 要 是 發(fā) 生 在 泛 素 的 七 個(gè) 賴 氨 酸 11/K27/K29/K33/K48/K63），從而形成賴氨酸連接的多聚泛素鏈； N 末端的蛋氨酸形成線性多聚泛素鏈。另外，泛素鏈可能會(huì)被去（DUBs）。如圖 2 所示，泛素由 UBB 和 UBC 基因編碼，是一個(gè)蛋白。泛素連接到靶蛋白的過程分為三步。病毒感染機(jī)體后可以3 來調(diào)節(jié)泛素修飾的靶位點(diǎn)，也可以通過劫持宿主的 E3 使其功能

泛素修飾系統(tǒng)對(duì)抗病毒作用機(jī)制（JEM，，2016 Vol.213, No.1）LRs 激活的信號(hào)通路中， RIG-I 的 CARDs 結(jié)構(gòu)域發(fā)生 K63 位的多后會(huì)發(fā)生四聚化。泛素化修飾導(dǎo)致 RIG-I 在線粒體處發(fā)生積累，-CARD 與 MAVS 的相互作用。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的病毒感染引起的 RI位點(diǎn)是 K172，依靠 TRIM25 增加了這一位點(diǎn)的泛素化修飾[29]。TIG-I的CARDs結(jié)構(gòu)域中除了K172以外的另外兩個(gè)殘基：K154和K報(bào)道，這三個(gè)殘基被 RNF135 引起泛素化修飾[31]。USP3 通過移去鏈來抑制IFN-β的產(chǎn)生[32, 33]。在許多病毒感染中MAVS都作為了靶5 使 MAVS 上第 7 位和第 10 位的賴氨酸泛素化修飾，導(dǎo)致 MAVS酶水解[34]。線粒體膜上結(jié)合的 E3 蛋白 MARCH5 通過將 MAVS 第 位賴氨酸多聚泛素化修飾，有效地分解了 MAVS 的聚合并使 MANF5 促進(jìn)了 MAVS 第 362 位和第 461 位賴氨酸的多聚泛素化，然71 位和第 420 位賴氨酸被 AIP4 多聚泛素化修飾[36-38]。cIAP1 這個(gè)
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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9 唐時(shí)s

本文編號(hào)：2589260