【摘要】：研究目的:本研究從壓力-應(yīng)激的角度出發(fā),建立壓力-應(yīng)激大鼠模型,旨在通過組織形態(tài)學(xué)觀察、尿液兒茶酚胺代謝產(chǎn)物水平測定和心肌細(xì)胞能量代謝產(chǎn)物檢測的方法,就長期壓力-應(yīng)激刺激對大鼠心肌組織產(chǎn)生損傷的機(jī)制進(jìn)行探討。研究方法:1.動物模型的建立:將60只雄性SD大鼠根據(jù)體重和曠場試驗(yàn)評分隨機(jī)分為正常對照組(2周組、4周組和6周組)和應(yīng)激模型組(2周組、4周組和6周組),每組10只,對照組正常飼養(yǎng),模型組給予不可預(yù)測性復(fù)合應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)建立壓力-應(yīng)激大鼠模型。2.行為學(xué)評價:通過曠場試驗(yàn)和蔗糖水消耗試驗(yàn)結(jié)果來評定大鼠造模前后的行為學(xué)變化情況,作為壓力-應(yīng)激大鼠模型是否建立成功的依據(jù)。3.心肌組織形態(tài)學(xué)觀察:造模結(jié)束后,麻醉大鼠并對左心室取材制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色和Masson染色,觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。4.檢測Cx43蛋白表達(dá)水平:采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠心室肌組織Cx43蛋白表達(dá)水平。5.兒茶酚胺代謝產(chǎn)物含量測定:收集大鼠24 h尿液,用ELISA檢測試劑盒測定兒茶酚胺代謝產(chǎn)物香草扁桃酸(VMA)的含量。6.采用勻漿、差速離心法分離心肌組織線粒體,分別測定心肌組織細(xì)胞漿和線粒體細(xì)胞色素C含量。研究結(jié)果:1.行為學(xué)評價:與對照組相比,從應(yīng)激造模第4周起,模型組大鼠蔗糖水偏愛率顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),曠場試驗(yàn)中水平活動評分、垂直活動評分均顯著降低,糞便粒數(shù)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。2.組織形態(tài)學(xué)觀察:在光鏡下,從應(yīng)激造模第4周起,模型組大鼠組織HE染色可見心肌細(xì)胞排列紊亂,橫紋消失,細(xì)胞間隙增大,部分肌纖維斷裂、溶解,Masson染色可見心肌間質(zhì)纖維化,膠原纖維增生且排列無序,并隨著造模時間的延長纖維化程度加重。而對照組大鼠HE染色可見心肌細(xì)胞呈短柱狀,排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰完整,部分可見橫紋,形態(tài)及分布未見異常;Masson染色可見膠原纖維僅在心肌間質(zhì)及血管周圍少量分布。3.心肌組織Cx43蛋白表達(dá)水平:與對照組相比,模型組大鼠在應(yīng)激早期(2周)時Cx43蛋白表達(dá)無明顯變化;在應(yīng)激中期(4周)時Cx43蛋白表達(dá)降低,但與同期對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(平均光密度值分別為0.0211±0.0062vs 0.0259±0.0038,P0.05);在應(yīng)激后期(6周)時可見Cx43蛋白表達(dá)明顯降低,與同期對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(平均光密度值分別為0.0110±0.0028 vs 0.0268±0.0025,P0.001)。4.兒茶酚胺代謝產(chǎn)物測定結(jié)果:在應(yīng)激早期(2周),模型組大鼠香草扁桃酸(VMA)濃度顯著高于對照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。在應(yīng)激中期(4周)和后期(6周),這種差異持續(xù)存在且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。5.細(xì)胞漿、線粒體Cyt-C測定結(jié)果:在應(yīng)激早期(2周),與對照組相比,模型組大鼠心肌組織細(xì)胞漿和線粒體Cyt-C均無顯著性差異(P0.05)。在應(yīng)激中期(4周),模型組大鼠心肌組織細(xì)胞漿Cyt-C濃度稍有升高,但與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);線粒體Cyt-C濃度與同期對照組相比,無顯著差異(P0.05)。在應(yīng)激后期(6周),模型組大鼠心肌組織細(xì)胞漿Cyt-C含量顯著升高,與同期對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);線粒體Cyt-C含量顯著降低,與同期對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。研究結(jié)論:1.壓力-應(yīng)激可引起大鼠行為學(xué)特征改變,出現(xiàn)愉快感缺失、興趣減退、抑郁焦慮等情感變化,采用不可預(yù)測性復(fù)合應(yīng)激建立的大鼠模型可以作為壓力-應(yīng)激相關(guān)性疾病研究的實(shí)驗(yàn)動物模型。2.壓力-應(yīng)激可引起體內(nèi)交感神經(jīng)過度激活,導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化呼吸鏈能量代謝異常,引起心肌形態(tài)學(xué)異常改變,以及心律失常相關(guān)蛋白異常表達(dá),可能與猝死的發(fā)生相關(guān)。
【圖文】：

圖 2-1 VMA 標(biāo)準(zhǔn)品的配制示意圖（4）洗滌工作液的配制：將濃洗滌液按 1:25 倍用去離子水進(jìn)行稀釋。具作：用量筒量取 240 mL 去離子水倒入干凈燒杯中，再量取 10 mL 濃洗滌液上述含去離子水的燒杯中，充分?jǐn)嚢杌靹�。�?）HRP 標(biāo)記物工作液的配制：HRP 標(biāo)記物工作液按 1:100 倍用 HRP 標(biāo)稀釋液進(jìn)行稀釋。吸取 10 μL HRP 標(biāo)記物加入到 990 μL HRP 標(biāo)記物稀釋液輕吹打混勻。HRP 標(biāo)記物工作液于臨用前 10 min 配制。（6）操作步驟：①加樣：按實(shí)驗(yàn)所需在酶標(biāo)板上設(shè)計(jì)好空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔。往標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔中加入 50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，并立即加入 HR記物工作液 50 μL，在實(shí)驗(yàn)臺上輕輕晃動酶標(biāo)板以助混勻，然后蓋上板貼放7℃溫浴箱中溫浴 60 min�？瞻卓撞患由鲜鲆后w。②洗板：溫浴 60 min 后用力甩干孔內(nèi)液體，每孔加入 200 μL 洗滌液，浸 min 后洗板。洗板時在實(shí)驗(yàn)臺上墊數(shù)層吸水紙包住酶標(biāo)板，用力朝下拍打數(shù)

圖 3-1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠體重變化情況注：***表示與對照組比較，，P＜0.001場試驗(yàn)結(jié)果評定激前，兩組大鼠在曠場試驗(yàn)中各項(xiàng)行為指標(biāo)的比較均無顯著差從第 2 周開始，模型組大鼠水平活動評分顯著減低（t=-3.568，P =數(shù)顯著增多（t=9.091，P＜0.001），這種差異自此之后一直存在，意義。而垂直活動評分在第 4 周開始模型組大鼠較對照組大鼠顯.575，P＜0.001），并一直存在于整個實(shí)驗(yàn)過程中。造模期間兩組行為學(xué)差異結(jié)果見表 3-2、表 3-3、表 3-4、圖 3-2A、圖 3-2B、圖表 3-2 應(yīng)激 2 周后大鼠曠場試驗(yàn)行為結(jié)果組間比較（ x ±s，n=10）組別 水平活動評分 垂直活動評分 糞便顆粒模型組 27.30 ± 11.71**12.10 ± 2.96 4.10 ± 0.74
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54;R-332

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