【摘要】：研究目的:本研究從壓力-應激的角度出發(fā),建立壓力-應激大鼠模型,旨在通過組織形態(tài)學觀察、尿液兒茶酚胺代謝產物水平測定和心肌細胞能量代謝產物檢測的方法,就長期壓力-應激刺激對大鼠心肌組織產生損傷的機制進行探討。研究方法:1.動物模型的建立:將60只雄性SD大鼠根據體重和曠場試驗評分隨機分為正常對照組(2周組、4周組和6周組)和應激模型組(2周組、4周組和6周組),每組10只,對照組正常飼養(yǎng),模型組給予不可預測性復合應激結合孤養(yǎng)建立壓力-應激大鼠模型。2.行為學評價:通過曠場試驗和蔗糖水消耗試驗結果來評定大鼠造模前后的行為學變化情況,作為壓力-應激大鼠模型是否建立成功的依據。3.心肌組織形態(tài)學觀察:造模結束后,麻醉大鼠并對左心室取材制作石蠟切片,進行HE染色和Masson染色,觀察心肌組織形態(tài)學變化。4.檢測Cx43蛋白表達水平:采用免疫組織化學法檢測大鼠心室肌組織Cx43蛋白表達水平。5.兒茶酚胺代謝產物含量測定:收集大鼠24 h尿液,用ELISA檢測試劑盒測定兒茶酚胺代謝產物香草扁桃酸(VMA)的含量。6.采用勻漿、差速離心法分離心肌組織線粒體,分別測定心肌組織細胞漿和線粒體細胞色素C含量。研究結果:1.行為學評價:與對照組相比,從應激造模第4周起,模型組大鼠蔗糖水偏愛率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),曠場試驗中水平活動評分、垂直活動評分均顯著降低,糞便粒數增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。2.組織形態(tài)學觀察:在光鏡下,從應激造模第4周起,模型組大鼠組織HE染色可見心肌細胞排列紊亂,橫紋消失,細胞間隙增大,部分肌纖維斷裂、溶解,Masson染色可見心肌間質纖維化,膠原纖維增生且排列無序,并隨著造模時間的延長纖維化程度加重。而對照組大鼠HE染色可見心肌細胞呈短柱狀,排列整齊,結構清晰完整,部分可見橫紋,形態(tài)及分布未見異常;Masson染色可見膠原纖維僅在心肌間質及血管周圍少量分布。3.心肌組織Cx43蛋白表達水平:與對照組相比,模型組大鼠在應激早期(2周)時Cx43蛋白表達無明顯變化;在應激中期(4周)時Cx43蛋白表達降低,但與同期對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(平均光密度值分別為0.0211±0.0062vs 0.0259±0.0038,P0.05);在應激后期(6周)時可見Cx43蛋白表達明顯降低,與同期對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(平均光密度值分別為0.0110±0.0028 vs 0.0268±0.0025,P0.001)。4.兒茶酚胺代謝產物測定結果:在應激早期(2周),模型組大鼠香草扁桃酸(VMA)濃度顯著高于對照組,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。在應激中期(4周)和后期(6周),這種差異持續(xù)存在且具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。5.細胞漿、線粒體Cyt-C測定結果:在應激早期(2周),與對照組相比,模型組大鼠心肌組織細胞漿和線粒體Cyt-C均無顯著性差異(P0.05)。在應激中期(4周),模型組大鼠心肌組織細胞漿Cyt-C濃度稍有升高,但與同期對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);線粒體Cyt-C濃度與同期對照組相比,無顯著差異(P0.05)。在應激后期(6周),模型組大鼠心肌組織細胞漿Cyt-C含量顯著升高,與同期對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001);線粒體Cyt-C含量顯著降低,與同期對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。研究結論:1.壓力-應激可引起大鼠行為學特征改變,出現愉快感缺失、興趣減退、抑郁焦慮等情感變化,采用不可預測性復合應激建立的大鼠模型可以作為壓力-應激相關性疾病研究的實驗動物模型。2.壓力-應激可引起體內交感神經過度激活,導致心肌細胞氧化呼吸鏈能量代謝異常,引起心肌形態(tài)學異常改變,以及心律失常相關蛋白異常表達,可能與猝死的發(fā)生相關。
【圖文】：

圖 2-1 VMA 標準品的配制示意圖（4）洗滌工作液的配制：將濃洗滌液按 1:25 倍用去離子水進行稀釋。具作：用量筒量取 240 mL 去離子水倒入干凈燒杯中，再量取 10 mL 濃洗滌液上述含去離子水的燒杯中，充分攪拌混勻。（5）HRP 標記物工作液的配制：HRP 標記物工作液按 1:100 倍用 HRP 標稀釋液進行稀釋。吸取 10 μL HRP 標記物加入到 990 μL HRP 標記物稀釋液輕吹打混勻。HRP 標記物工作液于臨用前 10 min 配制。（6）操作步驟：①加樣：按實驗所需在酶標板上設計好空白孔、標準品孔和待測樣品孔。往標準品孔和待測樣品孔中加入 50 μL 標準品或待測樣本，并立即加入 HR記物工作液 50 μL，在實驗臺上輕輕晃動酶標板以助混勻，然后蓋上板貼放7℃溫浴箱中溫浴 60 min�？瞻卓撞患由鲜鲆后w。②洗板：溫浴 60 min 后用力甩干孔內液體，每孔加入 200 μL 洗滌液，浸 min 后洗板。洗板時在實驗臺上墊數層吸水紙包住酶標板，用力朝下拍打數

圖 3-1 實驗期間大鼠體重變化情況注：***表示與對照組比較，，P＜0.001場試驗結果評定激前，兩組大鼠在曠場試驗中各項行為指標的比較均無顯著差從第 2 周開始，模型組大鼠水平活動評分顯著減低（t=-3.568，P =數顯著增多（t=9.091，P＜0.001），這種差異自此之后一直存在，意義。而垂直活動評分在第 4 周開始模型組大鼠較對照組大鼠顯.575，P＜0.001），并一直存在于整個實驗過程中。造模期間兩組行為學差異結果見表 3-2、表 3-3、表 3-4、圖 3-2A、圖 3-2B、圖表 3-2 應激 2 周后大鼠曠場試驗行為結果組間比較（ x ±s，n=10）組別 水平活動評分 垂直活動評分 糞便顆粒模型組 27.30 ± 11.71**12.10 ± 2.96 4.10 ± 0.74
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R54;R-332

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