【摘要】：本研究的主要目的是利用熱休克蛋白HSP65與α毒素免疫原性部分融合表達來增強疫苗的免疫效果,另外在本實驗室前期通過全人源噬菌體抗體庫篩選獲得的針對α毒素的全人源單鏈抗體的基礎(chǔ)上,進一步深入地研究該單鏈抗體的生物學(xué)活性,并利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建針對α毒素的全人源雙價單鏈抗體以提高單鏈抗體的結(jié)合活性,為防治A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素引起的各類疾病奠定基礎(chǔ)。本研究利用基因工程技術(shù),以CPA全基因為模板,PCR擴增rCPA基因(敲除了CPA編碼溶血性和致死性的酶活基因片段,保留具有免疫原性的部分),插入表達載體pET-28a(+)-HSP65,雙酶切及測序鑒定表明成功構(gòu)建重組表達載體pET-28a-rCPA-HSP65,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),以IPTG于34℃誘導(dǎo)表達5 h,表達產(chǎn)物進行12%SDS-PAGE分析,重組蛋白的相對分子量大小約為90kDa,而且大部分是以可溶形式產(chǎn)生的,表達量占菌體總蛋白的30.17%。接下來從培養(yǎng)基類型、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對其表達條件進行優(yōu)化并進行高密度發(fā)酵表達,產(chǎn)物經(jīng)一步DEAE弱陰離子交換層析柱上純化和復(fù)性后,再經(jīng)金屬螯合層析純化,純度達到95%左右。將純品rCPA-HSP65按常規(guī)免疫程序免疫小鼠,以rCPA和HSP65蛋白做對照,然后利用間接ELISA方法檢測各組小鼠外周血抗體滴度大小并進行了比較,融合蛋白rCPA-HSP65免疫后的小鼠外周血中和抗體水平持續(xù)增長,并在三免后平均中和抗體效價達212左右,且rCPA-HSP65組免疫的血清抗體效價明顯高于rCPA組。小鼠體內(nèi)毒素中和試驗顯示免疫血清可在體內(nèi)具有明顯中和α毒素的致死性作用。攻毒保護試驗顯示,以2×LD50的α毒素靜脈攻擊rCPA-HSP65免疫組的小鼠,可獲得80%以上的保護。將全人源抗CPA-scFv的菌株進行高密度發(fā)酵并經(jīng)IPTG以28℃誘導(dǎo)表達6 h左右,發(fā)酵后的菌液經(jīng)過離心收集上清,先經(jīng)60%飽和硫酸銨鹽析,用PB懸起后在PBS中透析過夜,經(jīng)過金屬螯合層析的粗純以及rProtein A親和層析精純,獲得純品scFv,相對分子量約為31 kDa,符合預(yù)期大小,純度為97%左右。WB法顯示在43 kDa處有一明顯的特異性免疫條帶,表明純化的scFv與CPA具有較好的免疫結(jié)合活性;利用表面等離子共振技術(shù)(SPR)進行結(jié)合動力學(xué)的精確分析,顯示scFv與CPA的平衡結(jié)合常數(shù)(KA)為2.02×1010(1/M),平衡解離常數(shù)(KD)為4.94×10-11(M);利用scFv在體外可以中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性的特點,將不同量的scFv與α毒素37℃下預(yù)先孵育2 h,然后分別于卵黃稀釋液和2%鼠紅細胞懸液以及羊血液瓊脂平板在37℃作用2 h,通過檢測反應(yīng)后的卵黃稀釋液的OD620和紅細胞懸液離心上清的OD450以及觀察血瓊脂板上的溶血情況表明,scFv具有良好的抑制CPA卵磷脂酶C活性的作用并能有效中和CPA的溶血活性,且兩者均具有濃度依賴性;在體內(nèi)中和試驗中,2×LD50劑量的CPA與抗體孵育后靜脈注射小鼠,與對照組相比,毒素與抗體按1:10和1:15時可以達到全部保護,而低于1:8時則會出現(xiàn)小鼠死亡,初步得出中和劑量為2×LD50毒素所需要的抗體最少劑量約為18.69 mg/kg,記為m(scFv)。在攻毒保護試驗試驗中,以2×m(scFv)的抗體靜脈注射小鼠,之后不同時間段以2×LD50攻毒,結(jié)果在注射抗體之后1小時攻毒保護率達到80%。在攻毒救治試驗中,以2×LD50劑量的毒素CPA提前靜脈攻毒小鼠,不同時間段用2×m(scFv)的抗體進行救治,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在30分鐘之內(nèi)救治率可達到80%以上,而超過1小時甚至2小時之后再救治小鼠幾乎全部死亡。結(jié)果表明用單鏈抗體救治CPA中毒時,快速準確診斷和及時治療是非常重要的。取CPA攻毒后抗體救治存活小鼠的各主要臟器進行病理組織學(xué)觀察,以攻毒后未救治而死亡的小鼠作對照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)未用抗體救治而死亡小鼠的臟器出現(xiàn)不同程度的嚴重病變,而用抗體救治存活小鼠病變輕微。然而,與完整單抗分子相比,具有單一結(jié)合位點的scFv結(jié)合力相對較低。另外,scFv另一特點是分子量較小,在體內(nèi)易被腎臟清除從而導(dǎo)致它的體內(nèi)不穩(wěn)定性。因此,我們利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建并表達了針對CPA的特異性雙價單鏈抗體并對其生物活性進行了初步研究,具體步驟如下:以單鏈抗體scFv全基因為模板,擴增兩條scFv基因片段并經(jīng)不同長度連接肽G4S或(G4S)3連接,亞克隆至原核表達載體pET-28a(+),經(jīng)雙酶切鑒定及基因測序結(jié)果表明正確構(gòu)建了雙價單鏈抗體sc(Fv)-G4S-sc(Fv)和sc(Fv)-(G4S)3-sc(Fv),分別簡記為sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15。將重組載體轉(zhuǎn)化原核表達菌株E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG于30℃誘導(dǎo)表達5 h并進行12%SDS-PAG分析鑒定,雙價單鏈抗體以包涵體形式表達為主,相對分子質(zhì)量與預(yù)期大小相同。對包涵體進行洗滌和變性溶解,經(jīng)銅離子金屬螯合層析粗純,目的蛋白洗脫液進行多步透析法復(fù)性,再經(jīng)rProtein-A親和層析純化和分子篩S-75最終精純,獲得純度較高的雙價單鏈抗體。利用間接ELISA法對雙價單鏈抗體與CPA的結(jié)合能力進行評價,結(jié)果顯示sc(Fv)2-15與CPA的結(jié)合活性高于scFv和sc(Fv)2-5。在體外毒素中和活性檢測中,等摩爾的scFv、sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15與CPA毒素孵育后分別與稀釋的卵黃液和鼠紅細胞懸液作用,結(jié)果顯示scFv、sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均可有效中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性,且sc(Fv)2-15中和效果明顯高于scFv和sc(Fv)2-5。在攻毒保護試驗中比較等摩爾量的抗體sc(Fv)2-15和scFv對小鼠進行預(yù)保護后不同時間靜脈攻毒的保護率,證實sc(Fv)2-15對小鼠的攻毒保護效果優(yōu)于scFv。本研究成功獲得了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的重組疫苗蛋白rCPA-HSP65并對其免疫效果進行了評價,深入地研究了針對α毒素全人源單鏈抗體的生物學(xué)活性并成功構(gòu)建了針對α毒素的全人源雙價單鏈抗體且提高了單鏈抗體的結(jié)合活性,為進一步研究A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的防治措施奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

bp 1 200均由 Graph Pad Pr， ***P ≤ 0.005% 普通瓊脂糖凝帶并且大小和預(yù)期A-HSP65 的雙酶切泳分析結(jié)果顯示920 bp 左右的片段用 DNAssist 2.2 軟目的載體中。

L2000；2：重組質(zhì)粒8a-rCPA-HSP65 雙酶ation of recombinant鑒定65 經(jīng) 12% SDS-PA-HSP65 表達，相式表達，，灰度掃描a M 1 2
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2576286