【摘要】：目的克隆、表達(dá)降鈣素原(PCT),制備相應(yīng)的多克隆抗體。方法根據(jù)GenBank上PCT的基因序列,設(shè)計(jì)10條用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PCT基因并構(gòu)建pGEX-KG-PCT重組質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白PCT-GST,然后用融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,Western blot法進(jìn)行生物活性鑒定,并利用瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了多克隆抗體的特異性和效價(jià)。結(jié)果成功獲得PCT全長(zhǎng)基因,重組質(zhì)粒pGEX-KG-PCT在大腸桿菌中成功表達(dá),SDS-PAGE電泳顯示蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)大小為36 000左右。利用純化的蛋白同時(shí)制備了GST和PCT-GST多克隆抗體,瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)顯示多克隆抗體可以特異性識(shí)別PCT,效價(jià)為1∶4。結(jié)論成功克隆、表達(dá)并純化出PCT蛋白,制備了相應(yīng)的多克隆抗體。
【圖文】：

A:PCR擴(kuò)增PCT基因結(jié)果．M:DNAmarker(20bpladder);1:PCT基因;B:pGEX-KG-PCT重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果．M:DNAmarker(100bpladder);1:雙酶切條帶．圖1PCR基因的克隆和pGEX-KG-PCT重組質(zhì)粒鑒定2．2目的蛋白的鑒定SDS-PAGE電泳的結(jié)果顯示，含重組質(zhì)粒pGEX-KG-PCT和pGEX-KG的菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后在對(duì)應(yīng)Mr位置均出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白帶，其大小與預(yù)測(cè)的融合蛋白的Mr大小一致。GST蛋白位于Mr29000左右，PCT-GST蛋白大小Mr為41000左右，融合蛋白有部分降解(圖2)。M:蛋白Mrmarker;1:PCT-GST融合蛋白;2:GST蛋白對(duì)照．圖2SDS-PAGE檢測(cè)重組PCT-GST蛋白和GST蛋白2．3Westernblot鑒定抗血清生物學(xué)活性用Westernblot法檢測(cè)重組蛋白免疫兔的抗血清，血清稀釋1∶500，可以得到清晰的條帶，，證明制備的多克隆抗體可以有效識(shí)別重組蛋白(圖3)。5期譚倩，等．降鈣素原基因克隆表達(dá)及多克隆抗體的制備505

M:蛋白Mrmarker;1:PCT-GST融合蛋白;2:GST蛋白對(duì)照．圖3Westernblot法鑒定重組蛋白生物學(xué)活性2．4PCT多克隆抗體的特異性和效價(jià)瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PCT多克隆抗體可以特異性識(shí)別PCT蛋白(表1)，多克隆抗體效價(jià)為1∶4。表1瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCT抗體特異性和效價(jià)抗原PCT多克隆抗體1∶11∶21∶41∶8GST±－－－PCT－GST++±－注:“±”為沉淀線模糊;“+”為沉淀線清晰;“－”為無沉淀線．3討論已證實(shí)PCT是一個(gè)具有高靈敏度、特異性的新指標(biāo)，比其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(如C反應(yīng)蛋白)能更早期鑒別細(xì)菌與非細(xì)菌感染［5－7］。PCT在臨床診斷中已成為判斷細(xì)菌早期感染的一項(xiàng)重要指標(biāo)［8－9］。目前，PCT的檢測(cè)有高效液相色譜法、膠體金和化學(xué)發(fā)光法等［10］。所用到的抗體主要為PCT單克隆抗體，但因試劑、儀器昂貴等原因使PCT檢測(cè)項(xiàng)目在我國(guó)難以推廣。利用多克隆抗體檢測(cè)PCT是使檢測(cè)費(fèi)用降低的有效途徑，但多克隆抗體存在特異性不高，靈敏度低等問題。因此，提高PCT多克隆抗體特異性和靈敏度是建立低廉快速檢測(cè)方法的前提條件。本項(xiàng)研究選用PCT-GST融合蛋白制備多克隆抗體，主要考慮到GST融合蛋白易于純化，且GST融合蛋白易于溶解，能產(chǎn)生較高效價(jià)的抗血清。由于多克隆抗體是用PCT-GST融合蛋白免疫兔制備，所以其與GST有一定的交叉反應(yīng)(表1)，但其反應(yīng)程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCT-GST蛋白，將PCT抗體1∶2稀釋后即無沉淀線產(chǎn)生;表明多克隆抗體可特異性識(shí)別PCT。人體血清中GST含量極低，目前沒有報(bào)道表明GST含量在正常人和病人中有顯著性差異，因此，所制備的PCT多克隆抗體具有較好的特異性，可以用于PCT的實(shí)驗(yàn)診斷。下一步工作便是找到合適的方法，提高PCT多克隆抗體檢測(cè)PCT的靈敏度，以到達(dá)臨床所需標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過基?

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2573536