【摘要】：目的克隆、表達降鈣素原(PCT),制備相應的多克隆抗體。方法根據(jù)GenBank上PCT的基因序列,設計10條用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技術擴增PCT基因并構建pGEX-KG-PCT重組質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達融合蛋白PCT-GST,然后用融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,Western blot法進行生物活性鑒定,并利用瓊脂免疫擴散實驗檢測了多克隆抗體的特異性和效價。結果成功獲得PCT全長基因,重組質(zhì)粒pGEX-KG-PCT在大腸桿菌中成功表達,SDS-PAGE電泳顯示蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)大小為36 000左右。利用純化的蛋白同時制備了GST和PCT-GST多克隆抗體,瓊脂免疫擴散實驗顯示多克隆抗體可以特異性識別PCT,效價為1∶4。結論成功克隆、表達并純化出PCT蛋白,制備了相應的多克隆抗體。
【圖文】：

A:PCR擴增PCT基因結果．M:DNAmarker(20bpladder);1:PCT基因;B:pGEX-KG-PCT重組質(zhì)粒雙酶切結果．M:DNAmarker(100bpladder);1:雙酶切條帶．圖1PCR基因的克隆和pGEX-KG-PCT重組質(zhì)粒鑒定2．2目的蛋白的鑒定SDS-PAGE電泳的結果顯示，含重組質(zhì)粒pGEX-KG-PCT和pGEX-KG的菌經(jīng)IPTG誘導表達后在對應Mr位置均出現(xiàn)相應的蛋白帶，其大小與預測的融合蛋白的Mr大小一致。GST蛋白位于Mr29000左右，PCT-GST蛋白大小Mr為41000左右，融合蛋白有部分降解(圖2)。M:蛋白Mrmarker;1:PCT-GST融合蛋白;2:GST蛋白對照．圖2SDS-PAGE檢測重組PCT-GST蛋白和GST蛋白2．3Westernblot鑒定抗血清生物學活性用Westernblot法檢測重組蛋白免疫兔的抗血清，血清稀釋1∶500，可以得到清晰的條帶，，證明制備的多克隆抗體可以有效識別重組蛋白(圖3)。5期譚倩，等．降鈣素原基因克隆表達及多克隆抗體的制備505

M:蛋白Mrmarker;1:PCT-GST融合蛋白;2:GST蛋白對照．圖3Westernblot法鑒定重組蛋白生物學活性2．4PCT多克隆抗體的特異性和效價瓊脂免疫擴散實驗結果證實PCT多克隆抗體可以特異性識別PCT蛋白(表1)，多克隆抗體效價為1∶4。表1瓊脂免疫擴散實驗檢測PCT抗體特異性和效價抗原PCT多克隆抗體1∶11∶21∶41∶8GST±－－－PCT－GST++±－注:“±”為沉淀線模糊;“+”為沉淀線清晰;“－”為無沉淀線．3討論已證實PCT是一個具有高靈敏度、特異性的新指標，比其他實驗室指標(如C反應蛋白)能更早期鑒別細菌與非細菌感染［5－7］。PCT在臨床診斷中已成為判斷細菌早期感染的一項重要指標［8－9］。目前，PCT的檢測有高效液相色譜法、膠體金和化學發(fā)光法等［10］。所用到的抗體主要為PCT單克隆抗體，但因試劑、儀器昂貴等原因使PCT檢測項目在我國難以推廣。利用多克隆抗體檢測PCT是使檢測費用降低的有效途徑，但多克隆抗體存在特異性不高，靈敏度低等問題。因此，提高PCT多克隆抗體特異性和靈敏度是建立低廉快速檢測方法的前提條件。本項研究選用PCT-GST融合蛋白制備多克隆抗體，主要考慮到GST融合蛋白易于純化，且GST融合蛋白易于溶解，能產(chǎn)生較高效價的抗血清。由于多克隆抗體是用PCT-GST融合蛋白免疫兔制備，所以其與GST有一定的交叉反應(表1)，但其反應程度要遠遠低于PCT-GST蛋白，將PCT抗體1∶2稀釋后即無沉淀線產(chǎn)生;表明多克隆抗體可特異性識別PCT。人體血清中GST含量極低，目前沒有報道表明GST含量在正常人和病人中有顯著性差異，因此，所制備的PCT多克隆抗體具有較好的特異性，可以用于PCT的實驗診斷。下一步工作便是找到合適的方法，提高PCT多克隆抗體檢測PCT的靈敏度，以到達臨床所需標準。本研究通過基?

【共引文獻】

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本文編號：2573536