【摘要】：鮑曼不動(dòng)桿菌（A. baumannii）是一種革蘭陰性的機(jī)會(huì)致病菌，能夠?qū)е露喾N感染性疾病，感染尤其易出現(xiàn)在免疫缺陷、昏迷、術(shù)后、創(chuàng)傷后及一些慢性疾病的住院患者中。鮑曼不動(dòng)桿菌感染所致死亡率在19-54%之間，其耐藥株的流行及其在環(huán)境中生存能力強(qiáng)等原因，都使其越來(lái)越引起人們的重視。鮑曼不動(dòng)桿菌此前一直被認(rèn)為是胞外菌，但近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌能夠粘附、侵入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并能夠在宿主細(xì)胞中生存。但宿主免疫與鮑曼不動(dòng)桿菌感染的關(guān)系和機(jī)仍不明確。 自噬是一種細(xì)胞程序化死亡過(guò)程，也是真核生物進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下得以存活，自噬起到非常重要的作用，它能夠清除一些多余的或老化的細(xì)胞器，以此維持代謝的平衡和某些細(xì)胞器的更新。該過(guò)程中一些損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，形成自噬小體，自噬小體通過(guò)與溶酶體融合，最終在自噬溶酶體中降解。 自噬已被發(fā)現(xiàn)與機(jī)體控制多種細(xì)胞內(nèi)微生物感染有關(guān)，鮑曼不動(dòng)桿菌是否會(huì)介導(dǎo)自噬的發(fā)生，自噬對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的感染有何作用，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌在哺乳細(xì)胞中是否能誘導(dǎo)自噬反應(yīng)進(jìn)行了探索。 本研究旨在明確鮑曼不動(dòng)桿菌是否能誘導(dǎo)哺乳細(xì)胞發(fā)生自噬，并在此基礎(chǔ)上研究其發(fā)生的起始過(guò)程（哪些配體蛋白參與）、信號(hào)通路及該自噬反應(yīng)對(duì)感染結(jié)局的影響，并探討在此反應(yīng)中鮑曼不動(dòng)桿菌的關(guān)鍵因子。 本研究采用LC3熒光表達(dá)蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后感染鮑曼不動(dòng)桿菌，應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑預(yù)處理及用自噬抑制劑預(yù)處理后感染鮑曼不動(dòng)桿菌，在共聚焦顯微鏡下觀察LC3熒光斑點(diǎn)形成情況；應(yīng)用透射電鏡觀察鮑曼不動(dòng)桿菌感染的HeLa細(xì)胞的自噬小體等結(jié)構(gòu)，以證實(shí)自噬的發(fā)生；應(yīng)用蛋白印跡法檢測(cè)感染鮑曼不動(dòng)桿菌的細(xì)胞的LC3表達(dá)情況，通過(guò)計(jì)算LC3-II/LC3-I比值來(lái)評(píng)判細(xì)胞自噬程度；通過(guò)免疫熒光染色法，研究胞內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌菌體與致敏蛋白的共定位關(guān)系，以判斷哪些蛋白參與了自噬的起始過(guò)程，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，敲除其中的某些蛋白后的細(xì)胞感染鮑曼不動(dòng)桿菌，通過(guò)免疫熒光染色及Western方法，判斷細(xì)菌與其他致敏蛋白共定位情況及LC3表達(dá)情況來(lái)明確某些蛋白在菌體致敏自噬過(guò)程中的作用；通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)及蛋白印跡技術(shù)，檢測(cè)胞內(nèi)菌體與LC3斑點(diǎn)、酸化溶酶體及LAMP1的共定位關(guān)系及p62在感染細(xì)胞中的表達(dá)情況，明確該自噬是否為完全自噬；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)及信號(hào)通路特異性抑制劑，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察及蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)LC3表達(dá)情況，研究該自噬的信號(hào)通路；應(yīng)用鮑曼不動(dòng)桿菌野毒株及其磷脂酶D突變株感染HeLa細(xì)胞，通過(guò)蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)LC3表達(dá)情況，研究磷脂酶D對(duì)該自噬的影響，并進(jìn)而通過(guò)磷脂酶D原核表達(dá)及免疫熒光技術(shù)，研究磷脂酶D對(duì)該自噬的影響的作用位點(diǎn)；最后，通過(guò)瓊脂糖平板細(xì)菌涂板及共聚焦顯微鏡觀察，鮑曼不動(dòng)桿菌感染巨噬細(xì)胞，明確自噬對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)菌清除的影響。 結(jié)果如下： （1）我們用鮑曼不動(dòng)桿菌感染HeLa細(xì)胞，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察及蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)，并通過(guò)透射電鏡觀察證實(shí)了感染鮑曼不動(dòng)桿菌的HeLa細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成。本研究也通過(guò)免疫熒光染色、蛋白印跡等方法，證實(shí)了該自噬為完全性自噬。 （2）鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)的自噬是通過(guò)泛素E3連接酶LRSAM1與泛素化蛋白包繞菌體，并與募集的自噬的配體蛋白NDP52及p62/SQSTM1作用而啟動(dòng)的。敲除骨架蛋白sept2和sept9后，，感染鮑曼不動(dòng)桿菌的細(xì)胞的p62/SQSTM1和NDP52不能在菌體周圍募集，鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)的自噬受到抑制，從而說(shuō)明鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)的自噬依賴于骨架蛋白成分。通過(guò)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)、特異性蛋白抑制劑，發(fā)現(xiàn)Beclin-1/Atg7/Atg8、MEK/ERK及AMPK-mTOR-ULK1信號(hào)通路參與了鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)哺乳細(xì)胞的自噬反應(yīng)的發(fā)生。 （3）最后，我們通過(guò)瓊脂糖涂板及光學(xué)觀察方法，應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑及抑制劑，證實(shí)了自噬能夠促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的清除。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了鮑曼不動(dòng)桿菌能夠誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)，也明確了自噬對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染的作用，為鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療提供了新思路。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于國(guó)內(nèi)外率先開(kāi)展對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌引起自噬現(xiàn)象及自噬對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究，并對(duì)其發(fā)生機(jī)制、信號(hào)途徑及鮑曼不動(dòng)桿菌參與自噬的蛋白分子進(jìn)行深入探索。
【圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述適應(yīng)環(huán)境壓力，并能做出改變的能力。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)天然耐藥機(jī)制的不為一個(gè)多重耐藥的病原體。鮑曼不動(dòng)桿菌具有強(qiáng)大的獲得耐藥性和克隆傳重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呈世界性流行，已成為我國(guó)院內(nèi)病原菌之一。曼不動(dòng)桿菌在抗生素壓力下，比如在一個(gè)高危環(huán)境下（在醫(yī)院監(jiān)護(hù)病房中被廣泛使用），有捕獲抗性基因的能力，基因多態(tài)性分析也印證了，鮑曼分的耐藥基因都是新近從綠膿桿菌、沙門菌屬或大腸桿菌獲得的（Fou。還有一些耐藥基因來(lái)源于遺傳，也有一些遺傳基因來(lái)源于偶然的突變。（動(dòng)桿菌耐藥性的出現(xiàn)可能是病人間相互傳播的征象，也可以當(dāng)成是鮑曼不發(fā)的一個(gè)預(yù)兆（Villegas，2003）。

圖 1.2 大自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬的模式圖Figure1.2 Model cart of macroautophagy, microautophagy and chaperone-mediatedautophagy1.3.2.2.1 大自噬對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的研究揭示了細(xì)胞生物學(xué)中控制蛋白質(zhì)降解的不同的關(guān)鍵方面。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)主要局限于針對(duì)哪些被破壞的蛋白，但細(xì)胞也需要處理更的受損的、可能有毒性的或多余的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中也包括完整的細(xì)胞器，而這都是噬能涉及的功能范圍（Yang，2010）。細(xì)胞質(zhì)里的某些胞質(zhì)內(nèi)容物或一些細(xì)胞器被隔進(jìn)一個(gè)雙層膜結(jié)構(gòu)中，這個(gè)雙層膜結(jié)構(gòu)通過(guò)延伸和閉合，形成一個(gè)封閉的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，被稱為自噬小體，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體。最后在自噬溶酶體中來(lái)自溶酶體的各種水解酶把這些內(nèi)容物降解、重新釋放回胞質(zhì)內(nèi)循環(huán)再利用。這個(gè)過(guò)稱為大自噬，即我們通常所說(shuō)的自噬。（圖 1.2）大自噬是介導(dǎo)細(xì)胞成分降解的主要
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2573788