【摘要】：目的建立小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)分離培養(yǎng)的方法,并將ADSCs移植于體內(nèi),觀察其致瘤性及肝臟歸巢情況。方法取皮下脂肪用0.075%Ⅰ型膠原酶消化,貼壁培養(yǎng)獲取小鼠ADSCs,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其表面分子、細(xì)胞周期;并將ADSCs注射到小鼠皮下觀察其致瘤性,及尾靜脈注射觀察其肝臟的歸巢。結(jié)果分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44,不表達(dá)CD34、CD45、CD11b、CD14;細(xì)胞周期顯示G0/G1、S、G2/M的細(xì)胞所占的比例分別為80.1%、7.9%、12%;ADSCs具有低免疫原性,不表達(dá)CD40、CD80、CD86、MHCI、MHCII以及PDL-1。在IFN-γ作用下,可輕度上調(diào)CD40、CD80以及PDL-1。ADSCs移植后未見(jiàn)成瘤,且可在肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)多處定居。結(jié)論膠原酶消化、貼壁培養(yǎng)可以從小鼠脂肪中分離出高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞,且ADSCs移植后能在肝內(nèi)定居。
【圖文】：

；每毫升細(xì)胞懸液中加入1μlCFSE，，5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育15min，期間注意混勻，全培洗滌2遍。用高糖DMEM將細(xì)胞重懸成1×107/ml；由尾靜脈注射100μl到正常BALB/c小鼠體內(nèi)（n=3）。7d后制取肝臟冰凍切片，DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察。以正常BALB/c小鼠的肝臟做對(duì)照。2結(jié)果2.1小鼠ADSCs的形態(tài)學(xué)觀察小鼠ADSCs接種于培養(yǎng)皿24h后，可見(jiàn)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，48hr后換液去除非貼壁細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)出觸角，呈梭形或三角形；開(kāi)始幾天細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)1周左右，細(xì)胞60%~70%融合，成纖維樣生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)一致（圖1），之后細(xì)胞增殖速度明顯加快，很快能夠達(dá)到90%以上融合狀態(tài)，呈螺旋狀生長(zhǎng)。2.2小鼠ADSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)細(xì)胞傳代純化后取第3代ADSCs進(jìn)行流式檢測(cè)CD29、CD90（間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物），CD34（造血干細(xì)胞標(biāo)志物），CD45（白細(xì)胞標(biāo)志物），CD14（單核細(xì)胞標(biāo)志物），CD11b（巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）等表達(dá)，如圖2A，B所示，分離培養(yǎng)的ADSCs高表達(dá)CD29（99.8%）和CD44（93.7%）；CD34、CD45、CD11b和CD14的峰與ISOTYPE（同型對(duì)照）峰完全重疊，陽(yáng)性率為0，說(shuō)明ADSCs不表達(dá)CD34、CD45、CD11b和CD14。ADSCs具有低免疫原性，因此我們檢測(cè)了其表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，小鼠ADSCs不表達(dá)CD40，CD86，PDL-1，MHCI以及MHCII，這些免疫分子的峰與陰性對(duì)照峰完全重疊；CD80的峰較同型對(duì)照峰稍右移，表現(xiàn)為低表達(dá)CD80（圖2C）；而在IFN-γ刺激下，CD80、CD86、PDL-1的峰較同型對(duì)照峰右移，表現(xiàn)出輕度上調(diào)（圖3），其它免疫相關(guān)分子無(wú)明顯變化。2.3小鼠脂肪間充干細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)原代ADSCs長(zhǎng)滿(mǎn)后，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析：G0/G1、S、G2/M的細(xì)胞所占的比例分別為80.1%、7.9%、12%。分離培養(yǎng)的細(xì)胞大部

其它無(wú)明顯的變化。而且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ADSCs在體外不能刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)［12］，這些都為ADSCs的同種異體移植時(shí)逃逸宿主免疫監(jiān)控提供了理論上的可能。間充質(zhì)干細(xì)胞具有向肝細(xì)胞分化的潛能，最早在2005年報(bào)道細(xì)胞因子cocktail法可以誘導(dǎo)ADSCs向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)［13］，ADSC能夠分泌細(xì)胞因子和肝再生生長(zhǎng)ventsE10010110210393.7%ISOTYPECD442560AventsE10010110210399.8%ISOTYPECD292560BventsE100101102103ISOTYPECD802560C圖2小鼠ADSCs表面標(biāo)志物和免疫分子的表達(dá)Fig.2Surfaceandimmune-relatedmarkersexpressions(red)onmouseADSCs.A:CD44;B:CD29;C:CD80.ISOTYPE:Negativecontrol(Black).ventsE100101102103ISOTYPECD402560AventsE100101102103ISOTYPECD802560BventsE100101102103ISOTYPEPDL-12560C圖3IFN-γ對(duì)小鼠ADSCs表面免疫分子表達(dá)的影響Fig.3EffectofIFN-γontheexpressionofimmune-relatedmarkersonADSCs.A:CD40;B:CD80;C:PDL-1.圖4小鼠ADSCs的肝內(nèi)歸巢Fig.4CellhomingtotheliverofmouseADSCs.A:DAPI;B:CFSE;C:DAPIandCFSEoverlay.ABCOverlayCFSEDAPIhttp://www.j-smu.comJSouthMedUniv,2013,33(8):1151-1154··1153

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本文編號(hào)：2562007