【摘要】：目的利用裝甲R(shí)NA技術(shù)制備一種能夠應(yīng)用于戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)核酸檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)控品,為臨床上HEV核酸分子水平檢測(cè)提供可靠的質(zhì)控工具,為相關(guān)HEV的診斷試劑盒研發(fā)奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。方法設(shè)計(jì)將MS2噬菌體基因組的5’端部分非編碼區(qū)、成熟酶蛋白、衣殼蛋白以及部分復(fù)制酶起始位點(diǎn)等編碼基因與HEV ORF2/ORF3保守區(qū)部分基因序列串聯(lián)并合成目標(biāo)基因MS2-HEV。并將MS2-HEV基因克隆、插入原核表達(dá)載體p ET-28b中構(gòu)建p ET-28b-MS2/HEV重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)后,SDS-PAGE鑒定表達(dá)情況;將驗(yàn)證的表達(dá)菌體首先經(jīng)過(guò)超聲破碎、離心、取上清、去除核酸雜質(zhì)后再經(jīng)超濾離心純化、濃縮,電鏡分析鑒定假病毒形態(tài);穩(wěn)定性檢測(cè)包括DNase I、RNase A抗性試驗(yàn)以及在血液中保存期檢驗(yàn)三個(gè)方面,最終確定假病毒穩(wěn)定性參數(shù)。結(jié)果1、PCR鑒定及測(cè)序結(jié)果證明重組質(zhì)粒p ET-28b-MS2/HEV成功構(gòu)建,SDS-PAGE電泳檢測(cè)到14k Da的位置出現(xiàn)目的條帶表明重組MS2-HEV基因獲得有效表達(dá),超濾離心純化后的重組假病毒顆粒僅有一條目的帶無(wú)雜帶表明假病毒得到高純度純化濃縮。2、電鏡鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)直徑約27nm二十面體對(duì)稱(chēng)的假病毒顆粒,說(shuō)明假病毒組裝成功。RT-PCR鑒定得到349bp大小的目的條帶,這些結(jié)果表明設(shè)計(jì)的HEV保守基因序列成功地被包裝到重組HEV假病毒顆粒中。3、病毒顆粒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明制備的HEV假病毒能夠有效抵抗高濃度的DNase I和RNase A的降解作用,并且放置在血液中的假病毒顆粒,-20℃條件下可以持續(xù)保存六個(gè)月而無(wú)明顯降解。結(jié)論本研究成功的制備出HEV假病毒顆粒,并且該HEV假病毒顆粒具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性及仿真性,達(dá)到了作為RNA病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控品的基本要求。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R373.21

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本文編號(hào)：2555058