【摘要】：以嗜酸性乳桿菌MG株slp基因(表達(dá)S層蛋白的基因)為材料,應(yīng)用Genetyx軟件推導(dǎo)出其正確的開(kāi)放閱讀框(ORF),并用CPHmodels,Swiss-Model和Swiss-PdbViewer生物軟件預(yù)測(cè)SLP蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu);此外,構(gòu)建slp基因的原核表達(dá)載體pGEX-slp,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,成功表達(dá)出重組S層蛋白(S-layer protein,SLP),并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。結(jié)果表明,使用3種不同的軟件預(yù)測(cè)SLP蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)結(jié)果具有很高的相似性,其中α螺旋占3.33%,線性結(jié)構(gòu)占45%,無(wú)規(guī)則卷曲占51.67%,平均親水值為-0.262,親水氨基酸比例為59.1%;表達(dá)載體pGEX-slp在E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)出重組SLP蛋白,其GST融合蛋白的大小約為70ku。本研究結(jié)果為進(jìn)一步以SLP為材料的生物制品的制備和應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

Ｍ．ＤＮＡ標(biāo)準(zhǔn)ＤＬ５０００；１．ＰＣＲ產(chǎn)物Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ５０００；１．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ圖１ｓｌｐ基因的ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物Ｆｉｇ．１ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｌｐｇｅｎｅｂｙＰＣＲ２．２重組載體ｐＧＥＸ－ｓｌｐ的酶切鑒定和ＰＣＲ鑒定嗜酸性乳桿菌ｓｌｐ基因大小約為１２００ｂｐ，ｐＧＥＸ－４Ｔ－３大小約為５５００ｂｐ，將重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－ｓｌｐ用ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上，分別出現(xiàn)約５０００ｂｐ和１２００ｂｐ左右的特異性條帶（圖２）。ＰＣＲ鑒定結(jié)果如圖３所示，，在２０００ｂｐ和１０００ｂｐ之間有一特異性條帶，符合理論值１２６０ｂｐ的大校２．３嗜酸性乳桿菌ＳＬＰ蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測(cè)應(yīng)用Ｇｅｎｅｔｙｘ生物軟件推導(dǎo)出的ＳＬＰ蛋白質(zhì)氨基酸序列，嗜酸性乳桿菌ＭＧ株的ＳＬＰ蛋白共由４１４個(gè)氨基酸組成（圖４）。２．４ＳＬＰ蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用３種在線軟件對(duì)ＳＬＰ蛋白質(zhì)進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖５（Ａ～Ｃ）所示，３種不同軟件預(yù)測(cè)出３Ｄ空間結(jié)構(gòu)驚人相似，表明預(yù)測(cè)結(jié)果的高重復(fù)性。２．５ＳＤＳ－ＰＡＧＥ與Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析結(jié)果對(duì)重組菌經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳分析。如圖６所示，ＩＰＴＧ誘導(dǎo)５ｈ后在７０ｋｕ處出現(xiàn)了條帶（第２泳道），而未加ＩＰＴＧ的同一個(gè)菌樣在同一時(shí)間未出現(xiàn)類(lèi)似條帶（第１泳道）。以鼠抗ＧＳＴ血清為一抗，對(duì)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏ

ｌｐ）約在７０ｋｕ處出現(xiàn)特異性條帶，與ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結(jié)果相符，并在２７ｋｕ處也出現(xiàn)與對(duì)照組樣品（含ｐＧＥＸ－４ｔ－３空質(zhì)粒）相同的條帶（泳道２）。而對(duì)照組樣品（含ｐＧＥＸ－４ｔ－３空質(zhì)粒）除了２７ｋｕ處的特異性條帶以外還有一條明顯大于７０ｋｕ的非特異性條帶（泳道１）。Ｍ．ＤＮＡ標(biāo)準(zhǔn)ＤＬ５０００；１．ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ５０００；１．ＤｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙＢａｍＨⅠ／ＸｈｏⅠ圖２重組載體的ｐＧＥＸ－ｓｌｐ的雙酶切鑒定Ｆｉｇ．２ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｍｉｄｐＧＥＸ－ｓｌｐｂｙＢａｍＨⅠａｎｄＸｈｏⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ．ＤＮＡ標(biāo)準(zhǔn)ＤＬ５０００；１，２．ＰＣＲ產(chǎn)物Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ５０００；１，２．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ圖３重組載體的ＰＣＲ鑒定Ｆｉｇ．３ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－ｓｌｐｂｙＰＣＲ圖４ＳＬＰ蛋白質(zhì)的氨基酸序列Ｆｉｇ．４ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳＬＰｐｒｏｔｅｉｎ２０動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展２０１３年第３４卷第４期（總第２３８期）

【參考文獻(xiàn)】

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8 劉冠楠;姜建國(guó);;鹽生杜氏藻3-磷酸甘油脫氫酶基因的原核表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析[A];2010年中國(guó)農(nóng)業(yè)工程學(xué)會(huì)農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨華南地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)學(xué)研研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

9 劉少寧;楊金保;張興曉;陳智;高繼明;孔義波;朱巖麗;姜世金;;鴨圓環(huán)病毒FJ0601株Rep蛋白的原核表達(dá)及其抗血清制備[A];山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

10 曹冰玉;王永山;范紅結(jié);歐陽(yáng)偉;王忠燦;唐雨德;;近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因在大腸桿菌中的表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙宇軍;豬戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因表達(dá)及其基因特異性噬菌體展示肽庫(kù)構(gòu)建[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2005年

2 陳立志;牛源致病性壞死梭桿菌分離鑒定及其白細(xì)胞毒素免疫特性研究[D];吉林大學(xué);2008年

3 李靜;海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生產(chǎn)、基因克隆和表達(dá)的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2008年

4 孫照剛;傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表達(dá)、蛋白功能研究以及缺失該基因病毒的重組[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

5 鄭銀英;蘋(píng)果莖溝病毒和褪綠葉斑病毒分子變異研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

6 姜秀云;牛分枝桿菌主要保護(hù)性抗原基因的克隆、表達(dá)及免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 張曉鳴;人IL-16的原核表達(dá)與其功能的初步研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2000年

8 趙梓綱;白念珠菌磷脂酶B的原核表達(dá)、純化及功能驗(yàn)證[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

9 胡敬東;雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白基因克隆與表達(dá)的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

10 姜世金;Ⅰ型馬立克氏病病毒pp38和pp24基因的表達(dá)及序列測(cè)定與分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張淑華;心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)與應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2006年

2 王云瓏;擬南芥Athspr突變體的耐熱性分析及Athspr基因的原核表達(dá)[D];蘭州大學(xué);2010年

3 趙艷麗;水稻中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的原核表達(dá)及功能初步鑒定[D];東北師范大學(xué);2010年

4 李會(huì)娟;家蠶轉(zhuǎn)膠蛋白基因的原核表達(dá)及功能的初步研究[D];浙江理工大學(xué);2010年

5 丁彪;小鼠IFRG15基因在植入前胚胎及原核表達(dá)的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

6 鄭銀英;酵母pac-1基因的克隆、原核表達(dá)及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

7 劉潤(rùn)先;維生素A結(jié)合蛋白基因的克隆及原核表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

8 王利春;a型重組相思豆毒素A、B鏈蛋白的原核表達(dá)、純化及其生物活性分析[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2004年

9 王力;金絲桃素合成酶的基因克隆、表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

10 李河林;IBRV XA株的分離鑒定及其gD蛋白的原核表達(dá)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2554849