【摘要】：研究背景： 抗體藥物是當(dāng)前藥物研發(fā)的重點領(lǐng)域。作為一種重組蛋白,抗體藥物在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存以及體內(nèi)使用過程中,容易發(fā)生多種降解;其中脫酰胺和異構(gòu)化作用是兩種最常見的化學(xué)降解方式,影響抗體穩(wěn)定性、生物學(xué)活性及生物利用度。提高抗體藥物穩(wěn)定性對抗體成藥性至關(guān)重要。除提高穩(wěn)定性外,優(yōu)化抗體效應(yīng)功能也是增強(qiáng)抗體臨床療效的一個重要研究方向。治療性抗體雖然具有很強(qiáng)的靶向性,但是單獨(dú)用藥的治療效果有限,尤其是對于實體瘤的治療。細(xì)胞毒性藥物雖然對癌細(xì)胞具備很強(qiáng)的殺傷效力,但是缺乏靶向性,常常誤傷正常細(xì)胞,從而引起嚴(yán)重的毒副作用。抗體-小分子藥物偶聯(lián)物(ADC)利用抗體作為載體將細(xì)胞毒性藥物送至靶部位,并通過細(xì)胞內(nèi)吞效應(yīng)進(jìn)入溶酶體,釋放出細(xì)胞毒性藥物,從而達(dá)到專一性殺死癌細(xì)胞而不損傷正常組織細(xì)胞的作用。將抗體高特異性和細(xì)胞毒性藥物高毒性有機(jī)結(jié)合的ADC藥物成為提高抗體效應(yīng)功能的一個重要發(fā)展方向。Genentech公司的單抗藥物Herceptin是美國FDA批準(zhǔn)上市的第一個乳腺癌靶向治療的抗體藥物,2014年全球銷售額達(dá)68億美元。該藥物由于穩(wěn)定性等因素選擇了凍干制劑。研究顯示,Herceptin抗體可變區(qū)潛在的脫酰胺效應(yīng)、異構(gòu)化效應(yīng)是影響其穩(wěn)定性的主要因素之一。研究目的 本研究的目的是在保持抗體Herceptin生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上提高其穩(wěn)定性,優(yōu)化、篩選新的靶向HER2候選抗體;在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步構(gòu)建抗體-小分子藥物偶聯(lián)物,比較不同抗體、小分子藥物以及偶聯(lián)方式對ADC活性的影響,為進(jìn)一步的ADC藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。研究方法 借助計算機(jī)分子模擬及合理設(shè)計技術(shù)分析、確定Herceptin抗體可變區(qū)脫酰胺和異構(gòu)化熱點及優(yōu)化突變策略;利用基因定點突變技術(shù)突變Herceptin(T-m Ab1)抗體可變區(qū)兩個脫酰胺和異構(gòu)化的降解熱點LC-CDR1-Asn30、HC-CDR3-Asp102;通過真核表達(dá)、親和純化獲得突變體T-m Ab2;經(jīng)質(zhì)譜、肽圖對突變位點進(jìn)行鑒定后,利用液相、CE-SDS、ic IEF等對T-m Ab2的理化性質(zhì)進(jìn)行全面分析,通過SEC、IEC、肽圖質(zhì)譜等方法比對研究T-m Ab2與母本抗體T-m Ab1在不同p H條件下的長期、加速及高溫穩(wěn)定性;利用FACS、ELISA、體外細(xì)胞實驗及體內(nèi)抑瘤實驗對抗體T-m Ab2的生物學(xué)活性進(jìn)行評價。進(jìn)一步通過體外結(jié)合活性實驗及細(xì)胞殺傷實驗對T-m Ab1、T-m Ab2以及T-m Ab3(我室從頭設(shè)計制備的一株與T-m Ab1作用表位相同的抗體)與毒素分子DM1、MMAE偶聯(lián)形成的ADC進(jìn)行生物學(xué)活性對比研究。研究結(jié)果 1、通過距離幾何學(xué)、計算機(jī)圖形學(xué)技術(shù),借助搭建的抗體T-m Ab1與抗原HER2胞外區(qū)作用復(fù)合物結(jié)構(gòu),合理判定了二者相互識別的關(guān)鍵區(qū)域;利用計算機(jī)輔助分子模擬、對接技術(shù)對于抗體T-m Ab1輕鏈可變區(qū)潛在脫酰胺位點(LC-CDR1-Asn30)和重鏈可變區(qū)潛在的異構(gòu)化熱點(HC-CDR3-Asp102)進(jìn)行合理優(yōu)化突變,搭建新抗體T-m Ab2空間結(jié)構(gòu)及其與HER2胞外區(qū)相互作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)。T-m Ab1和T-m Ab2與HER2相互作用模式理論預(yù)測結(jié)果表明:與T-m Ab1相比,T-m Ab2的穩(wěn)定性提高,但與HER2的結(jié)合活性有所下降。2、質(zhì)譜、肽圖等研究結(jié)果顯示,在T-m Ab2抗體中,降解熱點LC-CDR1-Asn30、HC-CDR3-Asp102被成功突變?yōu)長C-CDR1-Gln30和HC-CDR3-Glu102;抗體理化性質(zhì)分析顯示,T-m Ab2與T-m Ab1具有相似的多聚體水平、相同的等電點,但是T-m Ab2的電荷變異體水平要明顯低于T-m Ab1。3、FACS、ELISA等體外結(jié)合活性實驗結(jié)果表明,T-m Ab2能夠特異地識別HER2抗原,但其結(jié)合活性要弱于T-m Ab1(約3倍);Biacore親和力分析結(jié)果與理論預(yù)測結(jié)果一致,抗體T-m Ab2親和力弱于母本抗體T-m Ab1(4.7 n M vs 1.0n M),兩者結(jié)合HER2抗原的結(jié)合速度相近,但是解離速度比T-m Ab1快大約5倍。T-m Ab2在體外細(xì)胞模型中能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,但其抑制活性略弱于T-m Ab1;在體內(nèi)移植瘤動物模型實驗中,與生理鹽水對照組相比,Herceptin#174;、T-m Ab1以及T-m Ab2均有明顯的抑瘤活性,且三者的抑瘤活性沒有明顯差異。4、在長期穩(wěn)定性(4℃)和加速穩(wěn)定性(25℃)研究中,p H 5.1、6.0和6.3條件下,T-m Ab1和T-m Ab2的穩(wěn)定性基本一致。在40℃高溫、不同p H條件下,T-m Ab1和T-m Ab2的多聚體水平也無明顯差異,但是二者的電荷變異體有顯著的差異。p H6.0和6.3條件下,抗體T-m Ab1可以檢測到明顯的由LC-CDR1-Asn30脫酰胺引起的酸性變異體(AP2),且隨著p H的增加AP2的含量也明顯增加;而T-m Ab2抗體則沒有檢測到酸性變異體(AP2)。T-m Ab1和T-m Ab2中均只有在p H 5.1條件下可檢測到酸性變異體AP1(由抗體Fc段VSNK序列中的N,在酸性條件下脫酰胺產(chǎn)生),且兩者之間無明顯差異。在T-m Ab1中,可以檢測到明顯的由HC-CDR3-Asp102異構(gòu)化產(chǎn)生的堿性變異體(BP1),且隨著p H的降低BP1的含量逐漸增加;而在T-m Ab2中未檢測到明顯的BP1變異體。并且,與T-m Ab1相比,T-m Ab2在抗體可變區(qū)進(jìn)行的氨基酸突變沒有引入新的翻譯后修飾。5、在乳腺癌細(xì)胞系SKBR3中,母本抗體T-m Ab1偶聯(lián)毒素分子DM1后結(jié)合活性無明顯變化,但偶聯(lián)毒素分子MMAE后結(jié)合活性略有下降;抗體T-m Ab2和T-m Ab3偶聯(lián)毒素分子DM1和MMAE后,結(jié)合活性無明顯變化。而在胃癌細(xì)胞系N87中,T-m Ab1、T-m Ab2和T-m Ab3分別與兩種毒素分子偶聯(lián)后,結(jié)合活性均有下降,其中T-m Ab1下降最為明顯。T-m Ab1-DM1、T-m Ab2-DM1和T-m Ab3-DM1三種ADC可明顯殺傷腫瘤細(xì)胞SKOV3和SKBR3,其殺傷活性無明顯差異;且均要明顯高于對胃癌細(xì)胞N87的殺傷;T-m Ab1-MMAE、T-m Ab2-MMAE和T-m Ab3-MMAE三種ADC對SKOV3和SKBR3均有明顯的殺傷作用,且殺傷活性無明顯區(qū)別;而三種ADC抗體對胃癌細(xì)胞的殺傷活性要明顯高于SKOV3和SKBR3。在SKOV3和SKBR3中,同一抗體偶聯(lián)不同毒素對細(xì)胞的殺傷無明顯差異;但在胃癌細(xì)胞N87中,抗體T-m Ab1、T-m Ab2、T-m Ab3偶聯(lián)MMAE形成的ADC的殺傷活性要明顯高于其偶聯(lián)DM1形成的ADC,分別高約12倍、42倍和28倍。結(jié)論： 1、Herceptin的脫酰胺和異構(gòu)化的兩個降解熱點突變后,其穩(wěn)定性明顯得到了提高,雖然其體外結(jié)合活性略有下降,但是不影響其體內(nèi)的抑瘤活性。2、抗體與DM1、MMAE等小分子偶聯(lián)形成的ADC細(xì)胞毒作用具有一定的細(xì)胞選擇性。三種抗體與DM1偶聯(lián)的ADC對SKOV3、SKBR3細(xì)胞的殺傷作用要強(qiáng)于N87細(xì)胞;而與MMAE偶聯(lián)的ADC對N87細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于對SKOV3及SKBR3細(xì)胞。并且,在胃癌細(xì)胞N87中,抗體偶聯(lián)MMAE形成的ADC的殺傷活性要明顯高于其偶聯(lián)DM1形成的ADC。本研究創(chuàng)新之處在于:本研究初步探討了借助計算機(jī)虛擬篩選提高抗體穩(wěn)定性的潛在策略�；谠摬呗�,以靶向HER2抗體Herceptin為模型,篩選獲得一個穩(wěn)定性提高、保持母本抗體生物學(xué)活性的新抗體T-m Ab2。抗體穩(wěn)定性提高有利于其保存。本研究還系統(tǒng)評價了不同毒素分子偶聯(lián)對抗體生物學(xué)活性的影響。研究提示,抗體-小分子偶聯(lián)物(ADC)的生物學(xué)活性具有一定的細(xì)胞選擇性。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：2541145