具有中和功能的抗單體C-反應蛋白單克隆抗體的制備及其初步應用
發(fā)布時間：2019-09-25 00:18
【摘要】：目的:制備單體C-反應蛋白(monomeric C-reactive protein,mCRP)的單克隆抗體。方法:用合成的人C-反應蛋白末端八肽氨基酸,與牛血清白蛋白偶聯后免疫BALB/c小鼠,取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按5∶1的比例融合,間接競爭ELISA法和有限稀釋法進行單克隆雜交瘤細胞的篩選;制備腹水抗體;采用Protein G親和層析法純化抗體,用間接ELISA和Western blot方法測定抗體特異性,并采用該單抗研究其對mCRP干預的乳大鼠心肌細胞的保護作用。結果:得到1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株,純化后的單克隆抗體純度達98%,抗體活性良好,并且該抗體可以降低mCRP導致的心肌細胞TGF-β的表達。結論:成功獲得1株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞,并對其初步應用進行了鑒定,并證實其可以中和mCRP引起的心肌細胞的損傷作用。
【圖文】：
ne-wayANOVA）比較各組間均數差異，P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2．1雜交瘤細胞株的建立細胞融合后經HAT培養(yǎng)液篩選以及間接ELISA檢測，取上清效價最高的細胞株采用有限稀釋法單克隆化3次。雜交瘤細胞株經培養(yǎng)14周后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且經液氮凍存、復蘇后，此細胞株仍能穩(wěn)定分泌特異性抗mCRP抗體。2．2單抗的純化小鼠腹腔接種分泌mCRP單抗的雜交瘤細胞后共獲得15ml腹水，采用ProteinG親和層析法提取純度較純、活性較好的mCRP抗體，進行SDS-PAGE（圖1）。2．3單抗的鑒定抗體的效價測定結果見圖2，表明所制備的mCRP抗體與mCRP蛋白有較好的親和力。Westernblot結果顯示所純化的mCRP抗體能與mCRP蛋白特異性結合，在23000處出現目的條帶，與mCRP蛋白的預期大小相符（圖3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀釋倍數純化的mCRP抗體SP2／0培養(yǎng)上清圖2抗mCRP抗體效價的檢測Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量標準；1、2為純化后的mCRP抗體（樣品經過還原，上樣量為30μg／孔）。圖1SDS-PAGE檢測純化的mCRP抗體Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
ne-wayANOVA）比較各組間均數差異，P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2．1雜交瘤細胞株的建立細胞融合后經HAT培養(yǎng)液篩選以及間接ELISA檢測，取上清效價最高的細胞株采用有限稀釋法單克隆化3次。雜交瘤細胞株經培養(yǎng)14周后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且經液氮凍存、復蘇后，此細胞株仍能穩(wěn)定分泌特異性抗mCRP抗體。2．2單抗的純化小鼠腹腔接種分泌mCRP單抗的雜交瘤細胞后共獲得15ml腹水，采用ProteinG親和層析法提取純度較純、活性較好的mCRP抗體，，進行SDS-PAGE（圖1）。2．3單抗的鑒定抗體的效價測定結果見圖2，表明所制備的mCRP抗體與mCRP蛋白有較好的親和力。Westernblot結果顯示所純化的mCRP抗體能與mCRP蛋白特異性結合，在23000處出現目的條帶，與mCRP蛋白的預期大小相符（圖3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀釋倍數純化的mCRP抗體SP2／0培養(yǎng)上清圖2抗mCRP抗體效價的檢測Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量標準；1、2為純化后的mCRP抗體（樣品經過還原，上樣量為30μg／孔）。圖1SDS-PAGE檢測純化的mCRP抗體Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年心血管科;江蘇省盛澤醫(yī)院心血管科;
【基金】：國家自然科學基金(30900602) 江蘇省科技廳自然科學基金(BK2011382) 江蘇省“六大人才高峰”(2011WSN-029)
【分類號】：R392-33
【圖文】：
ne-wayANOVA）比較各組間均數差異，P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2．1雜交瘤細胞株的建立細胞融合后經HAT培養(yǎng)液篩選以及間接ELISA檢測，取上清效價最高的細胞株采用有限稀釋法單克隆化3次。雜交瘤細胞株經培養(yǎng)14周后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且經液氮凍存、復蘇后，此細胞株仍能穩(wěn)定分泌特異性抗mCRP抗體。2．2單抗的純化小鼠腹腔接種分泌mCRP單抗的雜交瘤細胞后共獲得15ml腹水，采用ProteinG親和層析法提取純度較純、活性較好的mCRP抗體，進行SDS-PAGE（圖1）。2．3單抗的鑒定抗體的效價測定結果見圖2，表明所制備的mCRP抗體與mCRP蛋白有較好的親和力。Westernblot結果顯示所純化的mCRP抗體能與mCRP蛋白特異性結合，在23000處出現目的條帶，與mCRP蛋白的預期大小相符（圖3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀釋倍數純化的mCRP抗體SP2／0培養(yǎng)上清圖2抗mCRP抗體效價的檢測Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量標準；1、2為純化后的mCRP抗體（樣品經過還原，上樣量為30μg／孔）。圖1SDS-PAGE檢測純化的mCRP抗體Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
ne-wayANOVA）比較各組間均數差異，P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2．1雜交瘤細胞株的建立細胞融合后經HAT培養(yǎng)液篩選以及間接ELISA檢測，取上清效價最高的細胞株采用有限稀釋法單克隆化3次。雜交瘤細胞株經培養(yǎng)14周后仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，且經液氮凍存、復蘇后，此細胞株仍能穩(wěn)定分泌特異性抗mCRP抗體。2．2單抗的純化小鼠腹腔接種分泌mCRP單抗的雜交瘤細胞后共獲得15ml腹水，采用ProteinG親和層析法提取純度較純、活性較好的mCRP抗體，，進行SDS-PAGE（圖1）。2．3單抗的鑒定抗體的效價測定結果見圖2，表明所制備的mCRP抗體與mCRP蛋白有較好的親和力。Westernblot結果顯示所純化的mCRP抗體能與mCRP蛋白特異性結合，在23000處出現目的條帶，與mCRP蛋白的預期大小相符（圖3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀釋倍數純化的mCRP抗體SP2／0培養(yǎng)上清圖2抗mCRP抗體效價的檢測Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量標準；1、2為純化后的mCRP抗體（樣品經過還原，上樣量為30μg／孔）。圖1SDS-PAGE檢測純化的mCRP抗體Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年心血管科;江蘇省盛澤醫(yī)院心血管科;
【基金】：國家自然科學基金(30900602) 江蘇省科技廳自然科學基金(BK2011382) 江蘇省“六大人才高峰”(2011WSN-029)
【分類號】：R392-33
【參考文獻】
相關期刊論文 前1條
1 劉劍南;陳相健;戴健;馬繼政;楊笛;張寄南;;C-反應蛋白對體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞的影響[J];中國臨床康復;2006年21期
【共引文獻】
相關期刊論文 前3條
1 古江勇;袁谷;朱永宏;徐筱杰;;芪參益氣滴丸治療心血管疾病的計算藥理學研究[J];中國科學(B輯:化學);2009年11期
2 劉強;張丹丹;徐晉Y
本文編號：2541132
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/jichuyixue/2541132.html
最近更新
教材專著
