發(fā)布時間：2019-08-01 11:30

【摘要】：目的探討間充質(zhì)干細胞(MSCs)對血管內(nèi)皮祖細胞(EPCs)向內(nèi)皮細胞(ECs)分化的影響及其機制。方法1.分離、培養(yǎng)及擴增小鼠骨髓MSCs和EPCs;2.MSCs與EPCs在Transwell小室內(nèi)共培養(yǎng);3.倒置光學顯微鏡下觀察EPCs單獨培養(yǎng)組、MSCs與EPCs共培養(yǎng)組及血管內(nèi)皮生長因子組(VEGF組)細胞形態(tài)學發(fā)生的變化;4.免疫熒光、RT-PCR和Western-blot檢測各組內(nèi)皮細胞特異性表面標志CD31及血管性血友病因子(v WF)的表達;5.ELISA檢測EPCs單獨培養(yǎng)組、MSCs與EPCs共培養(yǎng)組及VEGF組細胞上清液中VEGF的表達;6.ELISA檢測間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(MSCCM)中VEGF的含量;7.MSCCM誘導(dǎo)EPCs,同時用VEGF抗體(Anti-VEGF)中和MSCCM,免疫熒光、RT-PCR和Western-blot檢測LG-DMEM組、MSCCM組、MSCCM+Ig G組、MSCCM+VEGF抗體組CD31和v WF的表達情況。結(jié)果1.在MSCs與EPCs共培養(yǎng)實驗中,我們把實驗分成了三組:EPCs單獨培養(yǎng)組、MSCs與EPCs共培養(yǎng)組、VEGF組,在細胞培養(yǎng)48 h后首先在倒置光學顯微鏡下觀察了各組細胞形態(tài)學發(fā)生的變化,結(jié)果顯示MSCs與EPCs共培養(yǎng)組、VEGF組細胞呈鵝卵石樣生長,而EPCs單獨培養(yǎng)組細胞呈細胞點狀、不規(guī)則樣生長。2.免疫熒光顯示MSCs與EPCs共培養(yǎng)組、VEGF組高表達CD31及v WF,EPCs單獨培養(yǎng)組低表達CD31及v WF;RT-PCR檢測了各組細胞CD31及v WF m RNA的表達情況,結(jié)果共培養(yǎng)組CD31、v WF表達(5.45±1.45,7.50±1.11),較EPCs單獨培養(yǎng)組表達(1.20±0.10,1.15±0.08)顯著升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義;VEGF組CD31、v WF表達(4.29±1.15,3.32±0.66),較EPCs單獨培養(yǎng)組表達(1.20±0.10,1.15±0.08)顯著升高(*P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。Western-blot檢測了各組細胞CD31及v WF蛋白表達情況,結(jié)果共培養(yǎng)組CD31、v WF表達(1378.23±67.81,141.70±8.50),較EPCs單獨培養(yǎng)組表達(519.87±72.83,28.20±3.40)顯著升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義;VEGF組CD31、v WF表達(917.33±19.92,69.36±5.45),較EPCs單獨培養(yǎng)組表達(519.87±72.83,28.20±3.40)顯著升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。共培養(yǎng)組CD31、v WF表達較VEGF組明顯升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。3.ELISA檢測了三組細胞上清液中VEGF的含量,結(jié)果對照組VEGF的含量為(85.47±8.80)pg/ml,共培養(yǎng)組VEGF的含量為(340.94±14.17)pg/ml,較對照組顯著升高(**P0.01)。VEGF組VEGF的含量為(360.67±13.47)pg/ml,較對照組明顯升高(**P0.01)。4.MSCs分泌VEGF,MSCCM中VEGF的含量為(166.03±11.09)pg/ml,較LG-DMEM中VEGF的含量(11.77±3.04)pg/ml顯著升高(**P0.01)。5.免疫熒光顯示MSCCM組、MSCCM+Ig G組高表達CD31及v WF,LG-DMEM組低表達CD31及v WF,MSCCM+VEGF抗體組CD31及v WF的表達較MSCCM組減弱。6.RT-PCR檢測了四組細胞CD31及v WF m RNA的表達情況,結(jié)果MSCCM組CD31、v WF表達(2.85±0.55,3.78±0.95),較LG-DMEM組表達(1.05±0.05,1.06±0.07)顯著升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義,MSCCM組CD31、v WF表達(2.85±0.55,3.78±0.95),較MSCCM+VEGF抗體組表達(1.88±0.16,2.30±0.39)顯著升高(*P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。7.Western-blot檢測了四組細胞CD31及v WF蛋白表達情況,結(jié)果MSCCM組CD31、v WF表達(278.06±7.52,87.13±7.60),較LG-DMEM組表達(93.80±7.75,29.40±4.32)顯著升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義;MSCCM組CD31、v WF表達(278.06±7.52,87.13±7.60),較MSCCM+VEGF抗體組表達(176.10±15.41,51.76±4.01)顯著升高(**P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1.體外MSCs與EPCs與共培養(yǎng)能促進其向ECs分化;2.MSCs促進EPCs向ECs分化,其機制或許是通過旁分泌VEGF完成的。
【圖文】：

倒置光學顯微鏡下細胞形態(tài)學的變化（100μm）

培養(yǎng)組（2-ΔΔCt，1.15 ± 0.08）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（*P < 0.05）。3.2.4 Western blot 顯示 ECs 特異性標志的蛋白表達情況圖 3H 和圖 3I Western blot 結(jié)果顯示：CD31 蛋白表達在 MSCs & EPCs 共培養(yǎng)著上調(diào)（IOD，Co-culture，1378.23 ± 67.81），較 EPCs 單獨培養(yǎng)組或 VEGF 組（ISingle culture：519.87 ± 72.83；VEGF group：917.33 ± 19.92）顯著升高，差異具有學意義（**P < 0.01）；CD31 蛋白表達在 MSCs & EPCs 共培養(yǎng)組（1378.23 ± 67.較 VEGF 組（917.33 ± 19.92）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（**P < 0.01）。vW白表達在 MSCs & EPCs 共培養(yǎng)組顯著上調(diào)（IOD，Co-culture，141.70 ± 8.50），較 E單獨培養(yǎng)組或 VEGF 組（IOD，，Single culture：28.20 ± 3.40；VEGF group：69.36 ± 5顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（**P < 0.01）；vWF 蛋白表達在 MSCs & EPCs 養(yǎng)組（141.70 ± 8.50）較 VEGF 組（69.36 ± 5.45）顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（< 0.01）。
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2521723