【摘要】：本論文主要研究了致病性鉤端螺旋體外膜蛋白LigA Big、LigB Big結(jié)構(gòu)域和布氏錐蟲Q388A3 PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)以及其分子作用機(jī)制。1.致病性鉤端螺旋體能夠表達(dá)具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的粘附因子,它們能夠結(jié)合宿主細(xì)胞的多種細(xì)胞外基質(zhì)成分。Lig(Leptospiral immunoglobulin-like)蛋白家族是具有超大分子量的存在于致病性鉤端螺旋體中的蛋白,他們都屬于免疫球蛋白超家族。LigA(Leptospiral immunoglobulin-like proteinA)是含有串聯(lián)的Big(Bacterial immunoglobulin-like)結(jié)構(gòu)域的一種外膜蛋白。研究表明LigA參與了致病性鉤端螺旋體與哺乳動物宿主細(xì)胞的結(jié)合的過程。我們利用NMR(nuclea magnetic resonance)波譜學(xué)的方法解析了 LigA中第四個Big結(jié)構(gòu)域,LigA4 Big結(jié)構(gòu)域。通過與其他的Big結(jié)構(gòu)域比較發(fā)現(xiàn)LigA4 Big結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一種類似的細(xì)菌免疫球蛋白樣折疊,暗示著Big結(jié)構(gòu)域家族擁有一些相同結(jié)構(gòu)特征。此外,LigA4 Big結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出一些明顯不同于經(jīng)典的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征。另一方面,Strains-all染料結(jié)合實驗和NMR化學(xué)位移微擾實驗揭示了 LigA4 Big結(jié)構(gòu)域具有鈣離子結(jié)合的特性。LigB是Lig蛋白家族中另一種膜表面蛋白并含有串聯(lián)的Big結(jié)構(gòu)域和一個非串聯(lián)的末端。經(jīng)實驗鑒定,LigB參與致病性鉤端螺旋體與宿主細(xì)胞的粘附過程。LigB其中一個串聯(lián)的Big結(jié)構(gòu)域(LigBCen2R Big結(jié)構(gòu)域)能夠與細(xì)胞外基質(zhì)成分纖粘蛋白的GBD(gelatin-binding結(jié)構(gòu)域)結(jié)合,暗示了 LigB在鉤端螺旋體侵染過程中可能起到重要作用。我們利用核磁共振波譜學(xué)的方法解析了 LigBCen2RBig結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)。LigBCen2RBig結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)中的10個β折疊片分布在3個不同的片層中,呈現(xiàn)出的免疫球蛋白樣折疊模式。ITC(isothermal titration calorimetry)實驗結(jié)果表明 LigBCen2R Big 結(jié)構(gòu)域?qū)︹}離子有很強(qiáng)的親和力。NMR化學(xué)位移微擾試驗鑒定出一些可能與鈣離子結(jié)合相關(guān)的一些氨基酸殘基。通過結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)LigBCen2R Big結(jié)構(gòu)域與其他的Big結(jié)構(gòu)域的有著相同的折疊模式同時也存在一些自身特有的特征。由于Lig蛋白家族在侵染宿主細(xì)胞過程中起到至關(guān)重要的作用,我們的研究為更好的理解鉤端螺旋體侵染機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2.PDZ結(jié)構(gòu)域是普遍存在蛋白相互作用的模塊之一,能夠識別靶蛋白羧基端的一段保守序列,總是存在于支架蛋白中。布氏錐蟲是一種能引起人類瞌睡病的真核寄生生物,我們首次研究了布氏錐蟲蛋白中的PDZ結(jié)構(gòu)域。Q388A3是布氏錐蟲中未知功能蛋白,全長有1634個氨基酸殘基包含一個位于羧基端的PDZ結(jié)構(gòu)域。我們通過NMR波譜學(xué)的方法解析了 Q388A3 PDZ結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)。Q388A3PDZ結(jié)構(gòu)域由5個β折疊片形成的片層以及包在外圍的2個α螺旋構(gòu)成的PDZ樣折疊模式。并且它與HtrA家族蛋白中的PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)類似。同時,Q388A3 PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一些與HtrAPDZ結(jié)構(gòu)域截然不同的結(jié)構(gòu)特征。NMR化學(xué)位移微擾以及表面離子共振試驗結(jié)果表明Q388A3 PDZ結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合OMP(outer membrane porins)-like小肽。除此之外,我們通過點突變和表面離子共振技術(shù)鑒定出參與Q388A3 PDZ結(jié)構(gòu)域與小肽結(jié)合的關(guān)鍵性氨基酸殘基。PDZ結(jié)構(gòu)域?qū)π‰牡挠H和能力受到小肽結(jié)合區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸殘基以及其結(jié)構(gòu)的直接影響。
【圖文】：

鉤端螺旋體的細(xì)胞壁具有革蘭氏陰性（Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）細(xì)菌的細(xì)胞壁特點逡逑（圖１．２）。細(xì)胞膜可分為細(xì)胞內(nèi)膜和細(xì)胞外膜（Ｃｕｌｌｅｎ邋ｅｔａｌ．，２００４）。肽聚糖層緊逡逑貼細(xì)胞內(nèi)膜，并且有ＦｅｏＡ－ＦｅｏＢ型離子通道、青霉素結(jié)合蛋白（ＰＢＰ）以及脂蛋逡逑白ＬｉｐＬ３１穿插在他們當(dāng)中（Ｌｏｕｖｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００６）。鉤端螺旋體的細(xì)胞外膜包含脂逡逑多糖ＬＰＳ邋（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、橫跨外膜的孔蛋白ＯｍｐＬｌ、細(xì)胞外膜內(nèi)表面脂逡逑蛋白ＵｐＬ３６以及外膜內(nèi)表面ＬｉｐＬ３２、ＬｉｐＬ４１和ＬｉｇＢ等。通過基因組分析鑒定逡逑出若干個ＴｏｎＢ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ受體（ＴＢＤＲ），其中三個參與梓檬酸鐵（ｉｒｏｎｃｉｒａｔ），逡逑去鐵敏（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）以及血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)（Ａｓｕｔｈｋａｒｅｔａｌ．，邋２００７），所需的能量逡逑由位于內(nèi)膜的ＴｏｎＢ－ＥｘｂＸ－ＥｘｂＤ復(fù)合體轉(zhuǎn)化提供。致病性鉤端螺旋體具有類似逡逑大腸桿菌的輸出系統(tǒng)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)外膜蛋白以及脂蛋白（Ｂｏｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００７）。脂蛋白首逡逑先通過Ｓｅｃ系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)輸然后與由ＬｏｌＤ、ＬｏｌＣ以及ＬｏｌＥ構(gòu)成的ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)子逡逑結(jié)合。而ＯＭＰ首先由Ｓｅｃ易位子轉(zhuǎn)運(yùn)，接下來在整合到磷脂雙分子層（Ｈｐｉｄ逡逑ｂｉｌａｙｅｒ）之前先后與周質(zhì)伴侶Ｓｋｐ以及ｏｍｐ８５結(jié)合。在鉤端螺旋體的胞質(zhì)膜中逡逑也發(fā)現(xiàn)了若干個ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)子，其中包括一個金屬陽離子攝取家族ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)子逡逑（Ｌｏｕｖｅｌ邋ｅｔａｌ．，，邋２００６）。和其他螺旋菌屬類似，內(nèi)生表毛位于細(xì)胞周質(zhì)（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）逡逑

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本文編號：2521272