發(fā)布時(shí)間：2019-05-14 20:07

【摘要】：PIAS1蛋白(protein inhibitor of activated STAT1),又稱鳥苷RNA解旋酶Ⅱ結(jié)合蛋白,屬于哺乳動(dòng)物PIAS超家族成員,后者因與STAT轉(zhuǎn)錄因子家族之間相互作用而得名。早期研究發(fā)現(xiàn),PIAS1作為PIAS超家族的一員,其擁有家族共有的RING保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)揮SUMO (small ubiquitin-related modifier) E3連接酶的作用,參與細(xì)胞增殖、分化,DNA損傷及炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞活動(dòng)。而其SAP及C末端結(jié)構(gòu)域則分別與病毒誘導(dǎo)的早期信號(hào)傳遞及干擾素下游信號(hào)放大過程有關(guān)。沉默/敲除PIAS1分子將增加干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)與機(jī)體抗感染能力。近期研究發(fā)現(xiàn),丙型肝炎(HCV)干擾素治療不應(yīng)答患者肝組織樣本中肝細(xì)胞核內(nèi)PIAS1分子(hPIAS1)較干擾素治療應(yīng)答患者及健康對(duì)照表達(dá)明顯增加。雖然乙型肝炎病毒(HBV)的致病機(jī)理與HCV不盡相同,但研究發(fā)現(xiàn)其擁有共同的炎癥信號(hào)通路及相關(guān)分子。作為經(jīng)典的嗜肝病毒之一,持續(xù)HBV病毒感染可進(jìn)展為肝硬化、肝癌等終末期肝病�，F(xiàn)有的治療慢性乙型肝炎(CHB)臨床藥物主要包括核苷(酸)類似物及a-干擾素,而后者在給藥者中的應(yīng)答率也僅20-30%。藥物治療療效欠佳的潛在機(jī)制正有待進(jìn)一步研究證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn),干擾素治療應(yīng)答率與HBV病毒載量相關(guān),且CHB患者干擾素應(yīng)答不良及T細(xì)胞活化失能與高HBV病毒感染有關(guān)�；颊叱霈F(xiàn)干擾素抗性的分子機(jī)制部分可能系肝炎病毒蛋白通過誘導(dǎo)炎癥調(diào)控分子,從而下調(diào)干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路�；谇捌谂R床數(shù)據(jù),我們觀察到CHB患者PegIFNa-2a治療應(yīng)答與不應(yīng)答兩組間在肝細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞中hPIAS1分子表達(dá)水平存在差異。故我們推斷HBV病毒蛋白可能誘導(dǎo)hPIAS1分子在肝臟中高表達(dá),這可能是干擾素治療失敗的眾多原因之一。為研究HBV編碼病毒蛋白是否能上調(diào)hPIAS1分子表達(dá)及探討相關(guān)的分子機(jī)制,我們進(jìn)行如下系列實(shí)驗(yàn)：首先,我們構(gòu)建了hPIAS1熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒hpias1p(-1300)LUC,并在CHO及HepG2細(xì)胞系中分別與HBV病毒蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBs、cDNA-HBx及pcDNA-HBc,或pcDNA3.1對(duì)照空載共轉(zhuǎn)染,同時(shí)轉(zhuǎn)染β-Gal作為檢測(cè)內(nèi)參,檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。研究發(fā)現(xiàn),在CHO及HepG2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs組的熒光素酶活性相對(duì)pcDNA3.1組熒光素酶活性分別增加2.9及3.6倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs、 cDNA-HBx、pcDNA-HBc或pcDNA3.1,進(jìn)行qRT-PCR及western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pcDNA-HBs組hPIAS1的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于空載組。通過上述研究表明,HBs蛋白能夠通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)肝細(xì)胞中hPIAS1基因的表達(dá)。其次,我們以hpiaslp(-1300)LUC質(zhì)粒為模板,構(gòu)建系列5’端缺失的啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。研究發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染HBs表達(dá)質(zhì)粒后hPIAS1啟動(dòng)子-507至-712區(qū)段(相對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))熒光素酶活性顯著增強(qiáng),該區(qū)可能與hPIAS1基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析我們認(rèn)為,TAL1:E47、Kid3、C/EBP gamma、MYOG/NFI及NFI分別為該區(qū)5個(gè)候選的可能順式作用元件。分別對(duì)hpias1p(-712)LUC進(jìn)行候選順式作用元件區(qū)定點(diǎn)突變,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHO細(xì)胞及HepG2細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染TAL1:E47、C/EBP gamma、 MYOG/NFI或NFI突變質(zhì)粒的熒光素酶活性較野生型質(zhì)粒明顯減弱。凝膠遷移試驗(yàn)(EMSA)及染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)(CHIP)進(jìn)一步在體外及細(xì)胞內(nèi)證實(shí)HBs蛋白存在時(shí),反式作用因子TAL1、E47、MYOG及NFI能特異性地與hPIAS1啟動(dòng)子順式作用元件結(jié)合。激光共聚焦試驗(yàn)同時(shí)也驗(yàn)證了HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBs后,較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組,其轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG及NFI在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增加,并出現(xiàn)核內(nèi)轉(zhuǎn)移。反之,當(dāng)我們運(yùn)用siRNA干擾TAL1、E47、MYOG及NFI的表達(dá),發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染HBs蛋白后hPIAS1啟動(dòng)子熒光素酶活性較未干擾組分別降低到64.3%,58.0%,59.9%and 63.1%,而非相關(guān)對(duì)照組較之無明顯變化。上述實(shí)驗(yàn)表明共轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、 MYOG及NFI是參與HBs蛋白上調(diào)hPIAS1基因的重要分子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs的HepG2細(xì)胞中炎癥相關(guān)信號(hào)通路ERK和p38MAPK磷酸化水平明顯升高,總蛋白中轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)及hPIAS1蛋白表達(dá)水平與P-ERK和P-p38MAPK表達(dá)水平呈時(shí)間正相關(guān),均在轉(zhuǎn)染后36-48小時(shí)達(dá)到峰值；核漿蛋白分離實(shí)驗(yàn)亦顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA-HBs的HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)TAL1、 E47、MYOG和NFI核內(nèi)表達(dá)明顯增多,發(fā)生核轉(zhuǎn)位�；谏鲜鰧�(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們進(jìn)一步運(yùn)用ERK及p38MAPK信號(hào)通路抑制劑PD098059和SB203580,發(fā)現(xiàn)分別使用ERK及p38MAPK通路抑制劑后的HepG2細(xì)胞pcDNA-HBs轉(zhuǎn)染組,其總蛋白TAL1、E47、MYOG和NFI表達(dá)及hPIAS1的表達(dá)均不同程度減弱,且TAL1、E47、MYOG和NFI的核轉(zhuǎn)位亦減少,而使用JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125與未使用抑制劑的pcDNA-HBs轉(zhuǎn)染組上述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)無明顯變化�？傊�,上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同說明HBs病毒蛋白通過活化ERK及p38MAPK信號(hào)通路,增加轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)并結(jié)合特定的順式作用元件區(qū),激活hPIAS1基因啟動(dòng)子,從而上調(diào)hPIAS1基因的表達(dá)。對(duì)于HBV感染者,提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行western blot試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)高HBV感染者,其ERK及p38MAPK信號(hào)通路磷酸化水平高于HBV檢測(cè)不到及健康對(duì)照者,其中P-ERK表達(dá)水平組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)結(jié)合激光共聚焦試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)高HBV感染者其轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)亦高于HBV檢測(cè)不到者或健康對(duì)照。在對(duì)CHB患者的肝穿組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),高HBV的CHB患者肝細(xì)胞核內(nèi)hPIAS1分子表達(dá)水平較HBV載量低的CHB患者或健康對(duì)照明顯增高。這些實(shí)驗(yàn)共同提示,高水平HBV感染患者體內(nèi)ERK及p38MAPK信號(hào)通路被激活,轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)增加,并且肝細(xì)胞核內(nèi)hPIAS1分子的表達(dá)也明顯增加。綜合上述研究,我們發(fā)現(xiàn)HBs病毒蛋白能上調(diào)hPIAS1基因的表達(dá),其主要是通過活化ERK及p38MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子TAL1、E47、MYOG和NFI的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)。本研究在分子水平上探討了HBV相關(guān)的干擾素信號(hào)通路負(fù)調(diào)控分子hPIAS1基因轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制,有助于揭示CHB抗病毒治療中病毒與宿主間相互作用的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,從而為尋找優(yōu)化CHB抗病毒治療的療效及潛在的分子干預(yù)靶標(biāo)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373.21

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王春梅,姜濤,周春燕;誘導(dǎo)心臟發(fā)生的早期信號(hào)通路[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2004年05期

2 吳小萍;陳曉萍;斯f亮;;絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路相關(guān)研究[J];生物學(xué)通報(bào);2006年06期

3 劉紅標(biāo);劉娟;;蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中信號(hào)通路的識(shí)別算法[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2008年03期

4 黎增輝;廖愛軍;;JNK信號(hào)通路[J];國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志;2010年03期

5 李春艷;高寧;侯穎春;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與人類腫瘤[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2014年05期

6 郭陳智;范華驊;;Wnt信號(hào)通路參與外周免疫調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2010年04期

7 孫小妹;毛萌;;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2006年04期

8 尹力,柳惠圖,王端順;微絲重組對(duì)DG-PKC信號(hào)通路的作用[J];科學(xué)通報(bào);1994年16期

9 過倩萍;邢欣榮;伍會(huì)健;;蛋白質(zhì)修飾對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年02期

10 羅肖;李惠俠;楊公社;;Wnt信號(hào)通路與前體脂肪細(xì)胞[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2007年10期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 程華;王文;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑[A];2011全國(guó)老年癡呆與衰老相關(guān)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議第三屆山東省神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師（學(xué)術(shù)）論壇論文匯編[C];2011年

2 蔣瑩;程華;張麗;艾厚喜;王文;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑[A];第一屆全國(guó)麻醉藥理專業(yè)委員會(huì)第二次學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

3 蔣瑩;程華;張麗;艾厚喜;王文;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑[A];中國(guó)成人醫(yī)藥教育論壇（4）[C];2011年

4 蔣瑩;程華;張麗;艾厚喜;王文;;經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)補(bǔ)益藥藥理專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)暨人參及補(bǔ)益藥學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文集[C];2011年

5 李艷菲;艾厚喜;孫芳玲;張麗;蔣瑩;王文;;Wnt信號(hào)通路研究新進(jìn)展[A];2013年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十三屆中國(guó)藥師周論文集[C];2013年

6 李艷菲;艾厚喜;孫芳玲;張麗;蔣瑩;王文;;Wnt信號(hào)通路研究新進(jìn)展[A];2013年全國(guó)老年性癡呆與相關(guān)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

7 李艷菲;艾厚喜;孫芳玲;張麗;蔣瑩;王文;;Wnt信號(hào)通路研究新進(jìn)展[A];第三屆中國(guó)藥理學(xué)會(huì)補(bǔ)益藥藥理專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

8 季宇彬;胡哲清;鄒翔;;MAPK信號(hào)通路及其研究進(jìn)展[A];轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

9 程華;孫芳玲;艾厚喜;張麗;蔣瑩;王文;;Wnt信號(hào)通路與血管發(fā)生[A];全國(guó)第三次麻醉藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

10 李林;;利用小分子探針研究經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——專題報(bào)告七[C];2014年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前6條

1 劉海英;美發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞信號(hào)通路互動(dòng)機(jī)制[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

2 記者 劉海英;英發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)通路新“剎車”蛋白[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

3 衣曉峰　陳英云 記者 李麗云;結(jié)腸癌發(fā)生中新的信號(hào)通路找到[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

4 記者 許琦敏;減肥信號(hào)受控于腦中“通訊員”[N];文匯報(bào);2008年

5 記者 劉海英;一種蛋白決定人的抗壓能力[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

6 通訊員 喬蕤琳 記者 衣曉峰 聶松義;癌癥中小分子和微小核苷酸有關(guān)聯(lián)[N];健康報(bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王森;乙型肝炎病毒表面抗原抑制TLR2和TLR4信號(hào)通路的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 尚果果;NRF2抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路的活化在糖尿病腎病中的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 孫鼎琪;Akt信號(hào)通路在膀胱腫瘤的進(jìn)展及化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

4 白秀峰;新基因Gsdma3對(duì)小鼠毛囊周期及Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 張俊波;PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌16M存活的分子機(jī)制研究[D];石河子大學(xué);2014年

6 成旭東;黃芪活性物質(zhì)篩選及基于PKC-ERK信號(hào)通路抑制肺癌的作用機(jī)理研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 路康;STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)CLL和MCL發(fā)生組蛋白去乙�；敢种苿┠退幍臋C(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

8 趙睿;Wnt信號(hào)通路在臂叢神經(jīng)根性撕脫傷誘發(fā)的神經(jīng)病理性痛中的作用機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

9 劉海燕;Sonic hedgehog信號(hào)通路對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其分子機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 祁義軍;胃腸道間質(zhì)瘤中Shh信號(hào)通路作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 韓紹芳;小鼠主要嗅覺表皮組織內(nèi)AC3缺失對(duì)相關(guān)因子及信號(hào)通路的影響[D];河北大學(xué);2015年

2 李玉娟;Hedgehog信號(hào)通路在大鼠急性胰腺炎中的作用及其對(duì)TNF-α、IL-10的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 趙玲玲;FLCN與PAT1相互作用調(diào)控mTORC1信號(hào)通路的機(jī)理研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

4 努爾古麗·蘇里坦;mir-260和mir-240調(diào)控錢蟲壽命的研究[D];華中師范大學(xué);2015年

5 王瑜;晚期糖基化終末產(chǎn)物和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號(hào)通路的影響及其機(jī)制探討[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 楊瑩瑩;microRNA-203通過APC介導(dǎo)活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

7 徐貞貞;PM2.5對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

8 徐國(guó)棟;芪蛭皺肺顆粒調(diào)控肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的研究[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(原名：甘肅中醫(yī)學(xué)院);2015年

9 陸兆雙;多聚左旋精氨酸促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞釋放炎癥因子IL-6、IL-8的信號(hào)通路研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

10 修麗梅;P38MAPK信號(hào)通路在肢體缺血預(yù)處理腦保護(hù)中的作用[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2477011