【摘要】：天然免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線,天然免疫應(yīng)答的活化,主要是通過模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),從而激活一系列相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。PRRs主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs),維甲酸誘導(dǎo)的基因I樣受體(RIG-I-like receptors, RLRs), NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)以及DNA受體。在天然抗病毒免疫中,I型干擾素的產(chǎn)生對(duì)于機(jī)體的抗病毒作用是非常重要的,機(jī)體受到病毒感染后,會(huì)引起轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活化,從而引起下游的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。Ⅰ型干擾素產(chǎn)生之后與相應(yīng)受體結(jié)合,引起干擾素誘導(dǎo)基因產(chǎn)物(ISG)的表達(dá),產(chǎn)生的眾多干擾素相關(guān)蛋白分子主要起到抵抗病毒感染的作用,通過抑制病毒的復(fù)制或是通過凋亡途徑引起被感染細(xì)胞的凋亡,協(xié)同發(fā)揮著抗病毒作用。因此,Ⅰ型干擾素對(duì)于機(jī)體的抗病毒作用是至關(guān)重要的。Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生主要依賴于轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活化,IRF3作為機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄因子,在Ⅰ型干擾素產(chǎn)生以及機(jī)體各信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用中都是至關(guān)重要的。與此同時(shí),IRF3作為機(jī)體抗病毒作用中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,IRF3的活化需要磷酸化,二聚化以及核轉(zhuǎn)位共同的參與,然而對(duì)于核內(nèi)活化形式IRF3的調(diào)節(jié)作用的研究目前來說還是不明確的。目前已有文章報(bào)道顯示去磷酸化以及泛素化可以抑制轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活性,接頭分子RACK1可以募集磷酸酶PP2A對(duì)磷酸化的IRF3進(jìn)行去磷酸化作用。也有文章報(bào)道,在SeV感染情況下,IRF3C末端的磷酸化可以促進(jìn)IRF3的蛋白酶體降解作用。但是,目前來說尚未明確能夠泛素化和降解核內(nèi)IRF3的E3連接酶。TRIM26分子屬于tripartite motif (TRIM) E3連接酶家族中的一員,在人類中,TRIM家族大約有超過70個(gè)成員。TRIM家族成員擁有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),主要包括N末端的一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域,一個(gè)或是兩個(gè)B-boxes結(jié)構(gòu)域,以及一個(gè)coiled coil結(jié)構(gòu)域,C末端是一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。目前已有很多報(bào)道發(fā)現(xiàn)E3連接酶在TLR,RLR,NLR以及DNA信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用,E3連接酶主要通過不同的蛋白質(zhì)修飾調(diào)節(jié)眾多信號(hào)通路中的接頭分子的蛋白質(zhì)表達(dá)水平或是蛋白活性的變化,從而起到影響相應(yīng)信號(hào)通路活性的作用。E3連接酶通常以K48偶聯(lián)的泛素化形式通過蛋白酶體途徑降解相應(yīng)的接頭分子,也可以通過K63偶聯(lián)的方式影響相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子的活性,同時(shí)E3連接酶也可以通過其他的泛素化形式如K11,K27等方式影響信號(hào)通路的活化。雖然目前已有很多關(guān)于E3連接酶在信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)機(jī)制被發(fā)現(xiàn),但是關(guān)于E3連接酶如何參與到核內(nèi)IRF3的活性調(diào)節(jié)還沒有明確的報(bào)道。一.研究目的：TRIM26作為TRIM家族中重要的一員,之前在天然免疫中的研究是非常少的,鑒于TRIM家族的相似結(jié)構(gòu)特點(diǎn),考慮TRIM26作為一種E3連接酶是否會(huì)在天然免疫應(yīng)答中起到泛素化修飾的作用,是否參與到TLR,RLR,NLR以及DNA信號(hào)通路介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生之中,并對(duì)機(jī)體的抗病毒免疫起到調(diào)控作用,同時(shí)驗(yàn)證TRIM26作用的靶分子以及是通過何種形式的泛素化形式起到相應(yīng)的作用。二.研究方法：1.病毒感染對(duì)TRIM26的調(diào)控1.1病毒感染對(duì)TRIM26表達(dá)的影響取小鼠的各種組織,利用Western Blotting方法,檢測(cè)小鼠各組織中的TRIM26蛋白的表達(dá)。用LPS和poly(I:C)刺激,以及SeV感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,利用Western Blotting方法檢測(cè)TRIM26在各種刺激以及感染情況下的表達(dá)變化。1.2 TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位構(gòu)建帶GFP熒光標(biāo)簽的TRIM26過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)觀察TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位,同時(shí),用LPS刺激或是SeV感染之后,免疫熒光檢測(cè)一下TRIM26定位的變化。2.TRIM26負(fù)向調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒免疫2.1 TRIM26過表達(dá)對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響在RAW264.7細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及IFN-β報(bào)告基因載體,培養(yǎng)過夜,之后用LPS和poly(I:C)刺激轉(zhuǎn)染過的RAW264.7細(xì)胞系,報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β活性水平。同樣方法,利用報(bào)告基因方法在穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4受體的HEK293細(xì)胞中檢測(cè)TRIM26對(duì)IFN-β報(bào)告基因的活性水平。2.2 TRIM26干擾之后對(duì)IFN-p產(chǎn)生的影響取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,利用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法,將TRIM26相應(yīng)的干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)巨噬細(xì)胞,用LPS和poly(I:C)刺激,以及SeV感染,ISD轉(zhuǎn)染相應(yīng)的時(shí)間,ELISA方法檢測(cè)IFN-p的產(chǎn)生變化。2.3 TRIM26的抗病毒影響將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,然后用VSV進(jìn)行感染,RT-PCR檢測(cè)IFN-p的產(chǎn)生變化以及VSV的mRNA水平的變化。將TRIM26過表達(dá)載體或是相應(yīng)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系,24小時(shí)后用VSV感染Hela細(xì)胞8小時(shí),收集細(xì)胞上清,利用病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒的數(shù)量。3.TRIM26靶分子的尋找3.1 TRIM26對(duì)IRF3報(bào)告基因的影響將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4的HEK293細(xì)胞之中,以及轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞之中,然后用相應(yīng)的配體進(jìn)行刺激,分別用LPS和poly(I:C):刺激TLR4,TLR3細(xì)胞系,以及SeV感染,ISD轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,利用報(bào)告基因方法檢測(cè)TRIM26對(duì)IRF3報(bào)告基因的活性水平的影響。3.2 TRIM26對(duì)接頭分子的影響在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及相應(yīng)的接頭分子：TRIF, MAVS, STING+cGAS和TBK1,提取細(xì)胞蛋白,用Western Blotting方法檢測(cè)TRIM26對(duì)IRF3磷酸化的影響。同樣,轉(zhuǎn)染TRIM26小干擾后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,Western Blotting方法檢測(cè)TRIM26干擾之后對(duì)IRF3磷酸化的影響。為了進(jìn)一步確定TRIM26的靶分子,在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及IRF3報(bào)告基因載體,報(bào)告基因方法檢測(cè)TRIM26對(duì)各個(gè)接頭分子TRIF, RIG-I, MAVS, TBK1和IRF3引起的IRF3報(bào)告基因活性的影響,進(jìn)一步明確TRIM26作用的靶分子。4.TRIM26對(duì)靶分子的泛素化及作用4.1 TRIM26與靶分子的相互結(jié)合取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,用LPS刺激以及SeV感染時(shí)間點(diǎn)之后,提取細(xì)胞蛋白,利用免疫共沉淀的方法,檢測(cè)內(nèi)源性的TRIM26與靶分子之間的相互結(jié)合情況。接下來,在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體與靶分子的過表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,提取細(xì)胞蛋白,利用過表達(dá)載體的標(biāo)簽作免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測(cè)外源性TRIM26與靶分子的結(jié)合情況。4.2 TRIM26對(duì)靶分子的泛素化在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體,靶分子的過表達(dá)載體以及泛素表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,加入蛋白酶體抑制劑MG132,4小時(shí),收取細(xì)胞蛋白,利用免疫共沉淀方法檢測(cè)靶分子的泛素化水平變化。構(gòu)建TRIM26的RING結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變體,如上方法,檢測(cè)TRIM26的E3連接酶活性突變失活之后,對(duì)靶分子的泛素化有何影響。取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染TRIM26小干擾后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,收取細(xì)胞蛋白,靶分子作免疫共沉淀,檢測(cè)TRIM26干擾后,靶分子內(nèi)源性泛素化的變化。4.3 TRIM26對(duì)靶分子的泛素化形式在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體,靶分子的過表達(dá)載體以及野生型泛素表達(dá)載體,K48位突變的泛素表達(dá)載體以及K63位突變的泛素表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中,用靶分子的標(biāo)簽抗體作免疫共沉淀,Western Blotting方法檢測(cè)TRIM26對(duì)靶分子存在的泛素化形式。構(gòu)建靶分子的泛素化位點(diǎn)突變體,如上所述實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)TRIM26作用于靶分子的泛素化位點(diǎn)。4.4 TRIM26與靶分子相互作用的細(xì)胞定位將TRIM26過表達(dá)載體與靶分子的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,24小時(shí)后,用LPS刺激,SeV,VSV感染,以及IFN-β刺激相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),利用免疫熒光檢測(cè)TRIM26與靶分子相互作用的細(xì)胞定位情況。接下來,可以根據(jù)上述免疫熒光的結(jié)果,構(gòu)建相應(yīng)的TRIM26或是靶分子的一系列突變株,利用免疫熒光進(jìn)一步檢測(cè)二者的定位變化。5TRIM26抗病毒的生理意義5.1 TRIM26對(duì)病毒引起的IFN-β的影響分別取TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,用LPS和poly(I:C)刺激或是用SeV和VSV進(jìn)行感染,分別收取細(xì)胞的mRNA以及細(xì)胞上清,用RT-PCR方法以及ELISA方法檢測(cè)TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠中IFN-β的mRNA變化以及細(xì)胞因子的變化。5.2 TRIM26對(duì)病毒復(fù)制的影響分別對(duì)TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠進(jìn)行VSV滴鼻實(shí)驗(yàn),之后分別取兩種老鼠的血清,肝臟以及肺臟,利用ELISA方法檢測(cè)IFN-β的細(xì)胞因子水平,同時(shí)取組織肝臟和肺臟的蛋白質(zhì),用VSV抗體檢測(cè)VSV病毒在肝臟和肺臟中的病毒滴度情況。同時(shí),取肺臟組織作HE病理切片染色,檢測(cè)TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠中對(duì)肺臟的病理損傷影響。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.病毒感染對(duì)TRIM26的調(diào)控1.1病毒感染誘導(dǎo)TRIM26的表達(dá)取小鼠各組織,利用Western Blotting方法,檢測(cè)小鼠各組織中的TRIM26蛋白的表達(dá),檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在小鼠的肺臟,胸腺,肝臟,脾臟,小腸以及腦組織之中,TRIM26都有大量的表達(dá),但是在心臟和腎臟之中表達(dá)較少。用LPS和poly(I:C)刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞時(shí),在4小時(shí)開始,TRIM26表達(dá)開始出現(xiàn)增加,12到16小時(shí)時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰,在SeV感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞時(shí),利用Western Blotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26的表達(dá)變化與LPS和poly(I:C)刺激時(shí)相似。這說明TRIM26有可能參加到病毒感染引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之中。1.2病毒感染引起TRIM26的入核為了明確TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位,我們構(gòu)建帶GFP熒光標(biāo)簽的TRIM26過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)觀察TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位,發(fā)現(xiàn)TRIM26在沒有刺激的情況下是定位在細(xì)胞質(zhì)中的。在細(xì)胞受到SeVVSV感染8小時(shí)時(shí),免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26出現(xiàn)明顯的入核現(xiàn)象,同時(shí),用LPS刺激穩(wěn)定表達(dá)TLR4的HEK293細(xì)胞時(shí),免疫熒光檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)TRIM26出現(xiàn)明顯的核定位現(xiàn)象。綜上訴述情況說明TRIM26在病毒感染時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核定位現(xiàn)象。2.TRIM26負(fù)向調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒免疫2.1 TRIM26抑制病毒感染引起的IFN-β的產(chǎn)生為了驗(yàn)證TRIM26在抗病毒免疫反應(yīng)中的作用,我們用報(bào)告基因的方法檢測(cè)TRIM26對(duì)眾多的PRRs引起的下游的IFN-β表達(dá)的影響。在RAW264.7細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及IFN-β報(bào)告基因載體,培養(yǎng)過夜,之后用LPS和poly(I:C)刺激轉(zhuǎn)染過的RAW264.7細(xì)胞系,報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體的RAW264.7細(xì)胞系的IFN-β報(bào)告基因活性明顯變?nèi)酢Ｍ瑯臃椒?利用報(bào)告基因方法在穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4受體的HEK293細(xì)胞中檢測(cè)TRIM26對(duì)IFN-β報(bào)告基因的活性水平也是出現(xiàn)了明顯的下降。接下來,我們?cè)贖EK293以及Hela細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體以及IFN-β報(bào)告基因載體,轉(zhuǎn)染過夜之后,用SeV感染以及poly(I:C)轉(zhuǎn)染進(jìn)行刺激,轉(zhuǎn)染ISD以及poly(dA:dT)之后,報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26能明顯下調(diào)各種刺激引起的IFN-β的報(bào)告基因活性。2.2 TRIM26干擾之后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響為了更加直接的研究TRIM26對(duì)于IFN-β產(chǎn)生的影響,我們?cè)O(shè)計(jì)了TRIM26的小干擾RNA進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,利用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法,將TRIM26相應(yīng)的干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染36-48小時(shí)之后,用LPS和poly(I:C)刺激,以及SeV感染,ISD轉(zhuǎn)染分別6小時(shí)和12小時(shí),ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26被干擾掉之后,IFN-β的產(chǎn)生出現(xiàn)明顯的升高。這些結(jié)果說明TRIM26對(duì)病原微生物尤其是病毒感染之后引起的IFN-β的產(chǎn)生具有抑制作用。2.3 TRIM26的抗病毒影響為了更加直接的研究TRIM26對(duì)于機(jī)體抗病毒的影響,將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,然后用VSV進(jìn)行感染,RT-PCR檢測(cè)IFN-β的產(chǎn)生變化以及VSV的mRNA水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體的Hela細(xì)胞系,產(chǎn)生的IFN-p,相對(duì)比于轉(zhuǎn)染了空載體的Hela細(xì)胞系來說,IFN-β的表達(dá)明顯下降,同時(shí)VSVmRNA水平在轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體的細(xì)胞系中,出現(xiàn)明顯的升高,說明了TRIM26對(duì)抗病毒作用具有負(fù)向調(diào)控作用。接下來,將TRIM26過表達(dá)載體或是相應(yīng)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系,24小時(shí)后用VSV感染Hela細(xì)胞8小時(shí),收集細(xì)胞上清,病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26過表達(dá)之后,VSV病毒空斑數(shù)量明顯增多,相似的情況,當(dāng)用TRIM26小干擾RNA之后,VSV病毒空斑數(shù)量出現(xiàn)相應(yīng)的較少,病毒空斑實(shí)驗(yàn)說明了TRIM26對(duì)機(jī)體的抗病毒反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控作用。3.TRIM26靶分子是轉(zhuǎn)錄因子IRF33.1 TRIM26抑制IRF3報(bào)告基因的活性為了研究TRIM26對(duì)于IRF3活性的直接作用,設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn),將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4的HEK293細(xì)胞之中,以及轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞之中,然后用相應(yīng)的配體進(jìn)行刺激,分別用LPS和poly(I:C)刺激TLR4,TLR3細(xì)胞系,以及SeV感染,ISD轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,報(bào)告基因方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無論是在293 TLR3,TLR4穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系還是Hela細(xì)胞系之中,配體刺激引起的IRF3報(bào)告基因活性在轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體情況下,IRF3報(bào)告基因的活性水平都出現(xiàn)了明顯的下降。3.2 TRIM26對(duì)接頭分子的影響在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及相應(yīng)的接頭分子：TRIF, MAVS, STING+cGAS和TBK1,共轉(zhuǎn)染過夜之后,提取蛋白用Western Blotting方法檢測(cè)IRF3磷酸化的變化,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了過表達(dá)載體TRIM26之后,各接頭分子引起的IRF3的磷酸化水平都出現(xiàn)了明顯的下降。同樣,轉(zhuǎn)染TRIM26小干擾36小時(shí)之后后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,Western Blotting方法檢測(cè)TRIM26干擾之后,IRF3磷酸化的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的升高的情況。IRF3磷酸化水平的檢測(cè)說明TRIM26對(duì)各信號(hào)通路都具有抑制作用,說明TRIM26的作用具有共同性,很可能作用在各信號(hào)通路的共同存在的接頭分子上。為了進(jìn)一步確定TRIM26的靶分子,在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體,IRF3報(bào)告基因載體以及接頭分子TRIF, RIG-I, MAVS,TBK1和IRF3的過表達(dá)載體,報(bào)告基因方法檢測(cè)結(jié)果表明TRIM26對(duì)各個(gè)接頭分子引起的IRF3報(bào)告基因的活性都具有下調(diào)作用,這個(gè)結(jié)果表明TRIM26作用于各信號(hào)通路的靶分子很有可能是IRF3。4.TRIM26對(duì)靶分子IRF3的K48位泛素化及降解作用4.1 TRIM26與靶分子IRF3相互結(jié)合為了研究TRIM26分子對(duì)于靶分子的泛素化降解作用,取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,用LPS刺激以及SeV感染時(shí)間點(diǎn)之后,提取細(xì)胞蛋白,用內(nèi)源性IRF3抗體作免疫共沉淀,Western Blotting方法檢測(cè)內(nèi)源性的TRIM26與IRF3之間的相互結(jié)合,Co-IP實(shí)驗(yàn)表明在LPS刺激,SeV感染情況下,內(nèi)源性TRIM26與IRF3結(jié)合出現(xiàn)明顯的增強(qiáng)。接下來,在HEK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體與IRF3野生形式IRF3WT,磷酸化失活形式IRF35A以及活化形式的IRF35D三種過表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,提取細(xì)胞蛋白,利用IRF3過表達(dá)載體的標(biāo)簽作免疫共沉淀,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性TRIM26可以與IRF3 WT,5D形式的過表達(dá)載體相互結(jié)合,而和IRF35A這種磷酸化失活形式的過表達(dá)載體沒有檢測(cè)到結(jié)合,這說明TRIM26與IRF3的結(jié)合需要IRF3的活化。4.2 TRIM26對(duì)IRF3進(jìn)行泛素化因?yàn)門RIM26屬于E3連接酶TRIM家族中的一員,TRIM26含有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域,推測(cè)TRIM26很有可能作為一個(gè)E3連接酶在信號(hào)通路調(diào)解中發(fā)揮作用。因此,首先我們?cè)贖EK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體,IRF3的過表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,加入蛋白酶體抑制劑MG132,4小時(shí),收取細(xì)胞蛋白,利用IRF3的標(biāo)簽抗體作免疫共沉淀,用泛素抗體作蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)加入TRIM26過表達(dá)載體后,IRF3的泛素化出現(xiàn)明顯的增強(qiáng)。接下來我們構(gòu)建TRIM26的RING結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸16位的單突變體以及半胱氨酸16,36位的雙突變體,如上方法,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26 E3連接酶活性突變后,對(duì)靶分子的泛素化出現(xiàn)明顯的下降。為了更直接的驗(yàn)證TRIM26對(duì)IRF3泛素化的直接作用,我們采用體外泛素化表達(dá)體系,對(duì)TRIM26的泛素化作用進(jìn)行驗(yàn)證,通過體外表達(dá)體系以及體外泛素化體系驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)TRIM26可以與IRF3發(fā)生直接的結(jié)合,并且二者之間存在直接的泛素化作用。為了再進(jìn)一步明確TRIM26對(duì)IRF3的泛素化,我們?nèi)⌒∈蟮母骨辉奘杉?xì)胞,轉(zhuǎn)染TRIM26小干擾后,36小時(shí)之后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,收取細(xì)胞蛋白,用內(nèi)源性IRF3抗體作免疫共沉淀,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26干擾后,IRF3內(nèi)源性泛素化出現(xiàn)明顯的下降。4.3 TRIM26對(duì)IRF3進(jìn)行K48位泛素化接下來,為了驗(yàn)證TRIM26對(duì)IRF3進(jìn)行的位泛素化形式,我們?cè)贖EK293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體,IRF3的過表達(dá)載體以及野生型泛素表達(dá)載體,K48位突變的泛素表達(dá)載體以及K63位突變的泛素表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中,用IRF3的標(biāo)簽抗體作免疫共沉淀,Western Blotting方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26對(duì)IRF3存在K48位的泛素化形式修飾,而對(duì)于IRF3的K63位泛素化修飾沒有明顯的影響。為了進(jìn)一步確認(rèn)TRIM26能否促進(jìn)IRF3的泛素化,我們構(gòu)建了IRF3的泛素化位點(diǎn)賴氨酸70,87位點(diǎn)的突變體,這兩個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的選擇是根據(jù)已有文章報(bào)道進(jìn)行的推測(cè),如上所述實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IRF3的賴氨酸位點(diǎn)70,87位點(diǎn)突變之后,TRIM26對(duì)IRF3的泛素化修飾明顯下降。以上試驗(yàn)結(jié)果說明,TRIM26確是存在對(duì)IRF3的泛素化,并且是進(jìn)行K48位的泛素化而不是K63位的泛素化修飾。4.4 TRIM26與IRF3主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生相互作用為了確定TRIM26對(duì)IRF3泛素化降解作用的細(xì)胞定位,我們首先用SeV感染RAW264.7細(xì)胞系8小時(shí),之后提取細(xì)胞的核蛋白,用內(nèi)源性的IRF3抗體作免疫共沉淀,western檢測(cè)TRIM26與IRF3在細(xì)胞質(zhì)核里的相互結(jié)合,我們發(fā)現(xiàn)TRIM26主要在細(xì)胞核之中與IRF3發(fā)生相互結(jié)合,同時(shí),在SeV感染時(shí),二者的結(jié)合出現(xiàn)明顯的增強(qiáng),而在細(xì)胞質(zhì)之中,沒有檢測(cè)明顯的結(jié)合情況。上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了二者主要在細(xì)胞核中相互結(jié)合,那么我們考慮TRIM26發(fā)揮泛素化作用是不是也在細(xì)胞核之中,提取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染TRIM26的小干擾RNA,36-48小時(shí)之后,用SeV感染8小時(shí),分別提取細(xì)胞的質(zhì)核蛋白,用IRF3抗體做免疫共沉淀,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRI26干擾之后,主要影響了核內(nèi)IRF3的泛素化水平,而對(duì)細(xì)胞質(zhì)中的IRF3泛素化水平?jīng)]有明顯的影響。為了確定TRIM26是否作用于核內(nèi)活化形式的IRF3,我們?cè)贖EK293細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體的濃度梯度與IRF3 WT,5A,5D三種形式的過表達(dá)載體,24小時(shí)后,提取蛋白發(fā)現(xiàn)隨著TRIM26濃度梯度的增加,IRF3 WT,5D的蛋白表達(dá)量出現(xiàn)梯度下降的現(xiàn)象,而對(duì)IRF35A卻沒有明顯的表達(dá)變化的影響。接下來,我們共轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體與IRF3 WT過表達(dá)載體,之后用SeV感染,提取細(xì)胞質(zhì)核蛋白,western分析TRIM26在細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核之中對(duì)IRF3的降解情況, western發(fā)現(xiàn)TRIM26主要在細(xì)胞核之中對(duì)IRF3進(jìn)行降解,同時(shí)SeV感染會(huì)促進(jìn)TRIM26以及IRF3的入核,更進(jìn)一步說明TRIM26對(duì)核內(nèi)IRF3的泛素化作用。5核轉(zhuǎn)位促進(jìn)TRIM26對(duì)IRF3的降解作用5.1 IRF3的核轉(zhuǎn)位有利于TRIM26發(fā)揮降解作用為了明確TRIM26對(duì)IRF3泛素化降解確是發(fā)生在細(xì)胞核之中,我們構(gòu)建了IRF3 WT,5D的入核信號(hào)突變株IRF3KR77/78NG以及5DKR77/78NG,之后與TRIM26共轉(zhuǎn)染, western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26不能有效的降解IRF3 WT,5D的入核信號(hào)突變株IRF3 KR77/78NG以及5D KR77/78NG,這更加說明TRIM26對(duì)IRF3的降解很可能是發(fā)生在IRF3入核之后。接下來,為了進(jìn)一步確定TRIM26對(duì)IRF3的核內(nèi)降解作用,構(gòu)建了IRF3 WT以及5A,5D的出核信突變體IL139/140MM,共轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體之后,提取細(xì)胞核蛋白,發(fā)現(xiàn)TRIM26能夠在核內(nèi)降解IRF3 WT,5D出核信號(hào)突變體,但是不能降解IRF35A的出核信號(hào)突變體,以上這些結(jié)果表明,IRF3的核轉(zhuǎn)位對(duì)于TRIM26的降解作用是非常重要的。5.2 TRIM26核轉(zhuǎn)位促進(jìn)了IRF3的降解接下來,為了明確TRIM26核轉(zhuǎn)位對(duì)IRF3的降解的影響,我們構(gòu)建了TRIM26的入核信號(hào)突變體GFP-TRIM26-M-NLS,首先我們轉(zhuǎn)染這個(gè)入核突變體,用免疫熒光的方法驗(yàn)證構(gòu)建載體的入核情況,從免疫熒光可以看出來,GFP-TRIM26的入核信號(hào)突變之后,TRIM26在SeV,VSV感染情況下,入核現(xiàn)象都明顯減少,這說明突變效果是成功的。接下來,我們就用GFP-TRIM26-M-NLS與IRF3WT,5A,5D進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,檢測(cè)TRIM26入核信號(hào)突變之后對(duì)IRF3的降解的影響,western結(jié)果表明,當(dāng)TRIM26的入核信號(hào)突變之后,TRIM26失去了對(duì)IRF3WT,5A,5D的降解作用,這個(gè)說明TRIM26的入核對(duì)于降解IRF3是非常重要的。為了更進(jìn)一步說明核轉(zhuǎn)位的重要性,我們采用了入核抑制劑Ivermectin,之前有文章報(bào)道Ivermectin能有效的抑制轉(zhuǎn)錄因子的入核,我們也通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Ivermectin發(fā)揮作用的濃度與時(shí)間,共轉(zhuǎn)染了TRIM26和IRF3后,我們發(fā)現(xiàn)在Ivermectin作用下,TRIM26無法降解IRF3,從而說明了核轉(zhuǎn)位對(duì)于TRIM26降解IRF3的重要性。6TRIM26抗病毒的生理意義6.1 TRIM26抑制病毒引起的IFN-β的產(chǎn)生前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了TRIM26可以通過泛素化降解核內(nèi)的IRF3負(fù)向調(diào)控機(jī)體的抗病毒免疫,那么TRIM26對(duì)于抗病毒具有的生理意義,我們主要是使用TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠的模型進(jìn)行驗(yàn)證。分別取TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,用LPS和poly(I:C)刺激或是用SeV和VSV進(jìn)行感染,刺激或是感染相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)之后,分別收取細(xì)胞的mRNA以及細(xì)胞上清,用RT-PCR方法以及ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠中IFN-β的mRNA水平以及細(xì)胞因子的表達(dá)在刺激或感染情況下,相比較于野生鼠都出現(xiàn)了明顯的下降。6.2 TRIM26對(duì)病毒逃逸起到促進(jìn)作用接下來,我們分別對(duì)TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠進(jìn)行VSV滴鼻實(shí)驗(yàn),之后分別取兩種老鼠的血清,肝臟以及肺臟,利用ELISA方法檢測(cè)IFN-β的細(xì)胞因子水平,ELISA結(jié)果表明,TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠組,在VSV感染情況下,無論是血清還是肝臟,肺臟中的IFN-β表達(dá)水平都出現(xiàn)了明顯的下降,同時(shí)取組織肝臟和肺臟的蛋白質(zhì),用VSV抗體檢測(cè)VSV病毒在肝臟和肺臟中的病毒滴度情況發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因鼠組的VSV滴度是明顯高于野生鼠組的,肝臟,肺臟的病毒空斑實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠組的VSV空斑數(shù)是明顯高于野生組的。同時(shí),取肺臟組織作HE病理切片染色,從病理切片也可以看出,TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠中,病毒感染是比野生組出現(xiàn)嚴(yán)重的現(xiàn)象。最后,我們各取10只轉(zhuǎn)基因鼠和野生鼠,用VSV腹腔注射,觀察小鼠的生存曲線,發(fā)現(xiàn)TRIM26轉(zhuǎn)基因鼠組的死亡明顯快于野生鼠組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果說明TRIM26抑制病毒介導(dǎo)的IFN-p的產(chǎn)生,以及負(fù)向調(diào)控機(jī)體的抗病毒天然免疫。四.結(jié)論及創(chuàng)新性1.首次揭示了TRIM26作為E3連接酶在天然免疫中的作用TRIM26作為TRIM家族中的一員,其E3連接酶功能相對(duì)于其他家族成員來說,研究的不是很多,尤其是TRIM26在天然免疫中的作用,更是知之甚少,在這里,我們首先研究了TRIM26在抗病毒天然免疫中的作用,無論是在TLR,RLR還是DNA信號(hào)通路中,我們都做了詳細(xì)的驗(yàn)證與說明。我們的研究證實(shí)了TRIM26作為一種E3連接酶可以在天然免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。2.首次證實(shí)了TRIM26特異性的靶向作用于核內(nèi)的IRF3IRF3作為機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,IRF3的活化需要磷酸化,二聚化以及核轉(zhuǎn)位,之前雖有文章報(bào)道過IRF3可以被泛素化降解,但是到目前來說,沒有一個(gè)明確的研究證實(shí)在核內(nèi)降解活化形式的IRF3,我們的研究證實(shí)了TRIM26可以作為E3連接酶,入核之后,在細(xì)胞核之中與IRF3相互結(jié)合并且可以通過K48位泛素化降解核內(nèi)活化的IRF3,這在以前是沒有被發(fā)現(xiàn)過的,我們的研究進(jìn)一步完善了抗病毒天然免疫的調(diào)控機(jī)制。3.進(jìn)一步完善了病毒的逃逸機(jī)制病毒感染機(jī)體之后,機(jī)體會(huì)發(fā)生固有免疫,進(jìn)而產(chǎn)生適應(yīng)性免疫,產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子以及病毒清除機(jī)制,抵抗外界病毒的入侵,同樣,病毒自身也會(huì)通過各種機(jī)制來抵抗機(jī)體的各種免疫反應(yīng),兩種作用相互影響,使機(jī)體處于穩(wěn)定的狀態(tài)。我們研究發(fā)現(xiàn),病毒感染之后,TRIM26分子的表達(dá)出現(xiàn)明顯的升高,同時(shí)高表達(dá)的TRIM26可以降解轉(zhuǎn)錄因子IRF3,使IFN-β表達(dá)出現(xiàn)下降,從而使病毒更易逃逸,不被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除,正是由于存在負(fù)向調(diào)控的機(jī)制,才不至于使機(jī)體產(chǎn)生過量的IFN-β和細(xì)胞因子,產(chǎn)生自身免疫疾病,使機(jī)體處于穩(wěn)定的狀態(tài)。4.為臨床抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的思路病毒感染是全世界都面臨的一個(gè)非常棘手的問題,通過我們的研究,或許可以為臨床上治療一些疾病提供治療上的一些幫助,而且TRIM26可以作為藥物治療的靶點(diǎn),應(yīng)用于臨床疾病的診療之中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
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本文編號(hào)：2474751