【摘要】：第一章結核抗原持續(xù)刺激致T細胞耗竭實驗研究結核病是一種慢性感染性疾病,由結核分枝桿菌感染引起,是全球危害最為嚴重的傳染病之一。有研究報道嚴重的結核病患者CD4+T細胞,尤其是Th1細胞數(shù)目下降。我們也發(fā)現(xiàn)痰菌陽性的纖維空洞型結核病患者對結核分枝桿菌抗原的T細胞免疫應答能力低于密切接觸者和結核病新發(fā)病人。以上現(xiàn)象都提示嚴重的結核分枝桿菌感染可能造成機體免疫功能低下,其發(fā)生機制值得深入研究。目的:通過結核抗原持續(xù)刺激建立T細胞耗竭小鼠模型,分析抗原持續(xù)刺激在結核病T細胞耗竭中的作用及可能的機制和治療措施。方法:1,本研究采用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)免疫C57BL/6小鼠,用結核亞單位蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(簡稱LT70)聯(lián)合Mtb10.4-Hsp X(簡稱MH)反復免疫10次,模擬結核分枝桿菌抗原持續(xù)刺激的狀態(tài),建立T細胞耗竭模型。2,通過酶聯(lián)免疫斑點試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗分析脾臟T細胞IFN-γ和IL-2的分泌水平;通過流式細胞術檢測CD4+、CD8+T細胞數(shù)目;通過TB10.44-12五聚體標記檢測TB10.4特異性的記憶性CD8+T細胞數(shù)目;通過流式細胞術檢測CD4+/CD8+T細胞表面程序性死亡受體1(Programmed Death 1,PD-1)的表達;通過BCG和銅綠假單胞菌攻擊,檢測不同模型組保護效果差異;進一步檢測CD34-LinSca-1+c-Kit+造血干細胞的數(shù)量和增殖能力。3,在T細胞耗竭模型基礎上,應用造血干細胞、間充質干細胞、IL-2和雷帕霉素進行干預治療,檢測以下指標:抗原特異性細胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平;TB10.4特異性的記憶性CD8+T細胞的數(shù)量;CD4+T細胞表面抑制性受體PD-1的表達;BCG攻擊后的保護效果;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數(shù)量和增殖能力。通過上述指標檢測評價不同治療方案的治療效果。4,在IL-2具有逆轉T細胞耗竭作用的基礎上,進一步探索IL-2與造血干細胞增殖分化相關信號通路JAK-STAT和PI3K之間的關系,揭示IL-2逆轉T細胞耗竭的分子機制。結果:1,通過BCG免疫一次,結核亞單位疫苗LT70和MH加強免疫10次,成功建立T細胞耗竭模型。2,相比于結核抗原短暫刺激(加強免疫2次)組,T細胞耗竭組:細胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著性降低(p0.01);CD4+、CD8+T細胞數(shù)目顯著性減少(p0.05);TB10.44-12特異性的記憶性CD8+T細胞數(shù)量顯著減少(p0.05);CD4+T細胞表面抑制性受體PD-1表達水平升高(p0.05);BCG和銅綠假單胞菌攻擊后清除率下降(p0.05),機體抗感染保護能力明顯下降;CD34-Lin-Sca-1+c-Kit+造血干細胞的數(shù)量降低,其增殖能力被抑制(p0.05)。3,應用造血干細胞、間充質干細胞、IL-2和雷帕霉素進行干預治療后,相比于T細胞耗竭組,造血干細胞治療組和IL-2治療組具有逆轉T細胞耗竭的作用:細胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平顯著升高(p0.05);TB10.4特異性的記憶性CD8+T細胞的數(shù)量增加(p0.05);CD4+T細胞表面抑制性受體PD-1表達水平下降(p0.01);BCG攻擊后,造血干細胞治療組和IL-2治療組的細菌載量顯著低于T細胞耗竭未治療組;CD34-Lin-Sca-1+CD117+造血干細胞的增殖能力恢復(p0.05)。4,通過造血干細胞增殖分化相關通路JAK-STAT和PI3K研究發(fā)現(xiàn),激酶3(Janus Kinase 3,JAK3)蛋白主要在造血細胞中表達,T細胞耗竭組中骨髓造血干細胞內(nèi)轉錄因子STAT-5磷酸化水平被抑制,IL-2治療后可以恢復STAT-5的磷酸化。結論:應用結核抗原持續(xù)刺激建立T細胞耗竭動物實驗模型,該模型從一個側面說明大量細菌(抗原)刺激是結核分枝桿菌引起機體免疫功能低下的機制之一;T細胞耗竭后小鼠受特異性抗原刺激時IFN-γ等細胞因子分泌水平下降,CD4+和CD8+T細胞數(shù)目和增殖能力下降,CD4+T細胞表面抑制性受體PD-1表達上調(diào),造血干細胞分化為T細胞的能力降低;應用造血干細胞、IL-2治療后T細胞耗竭得以逆轉;進一步的研究發(fā)現(xiàn)IL-2主要通過激活JAK-STAT信號通路,使得轉錄因子STAT-5磷酸化,調(diào)控造血干細胞的增殖分化,從而恢復骨髓造血干細胞向T細胞分化的能力。第二章結核分枝桿菌融合蛋白LT70的構建及其保護效果研究結核病由結核分枝桿菌感染引起,是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時間最久、危害最為嚴重的傳染病之一。二十世紀八十年代以來,隨著耐藥菌株尤其是耐多藥結核菌及人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的傳播與流行,結核病在世界各地的發(fā)病率呈現(xiàn)回升趨勢,發(fā)病率和死亡率高居不下�，F(xiàn)階段結核病防治所使用的疫苗BCG是減毒牛分枝桿菌活疫苗。自1921年用于人類接種,能夠有效預防新生兒和兒童患嚴重的腦膜結核及全身粟粒性結核病,但是不能有效預防成人肺結核的發(fā)生。因此,新型結核疫苗的研究開發(fā)迫在眉睫。目的:通過建立針對休眠菌在內(nèi)的不同生長狀態(tài)的結核分枝桿菌有效的免疫應答,提高亞單位疫苗的免疫保護效力。方法:1,本研究選用結核分枝桿菌生長期抗原ESAT6、Ag85B、Mtb8.4、MPT64的190-198位的氨基酸多肽和潛伏期保護性抗原Hrp1(Rv2626c),構建無標簽融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)。2,該融合蛋白在大腸埃希菌E.coli BL21菌株中進行表達;通過條件優(yōu)化,使該蛋白可溶性表達;進而利用疏水柱層析和分子篩層析方法對其進行純化。3,將純化產(chǎn)物與佐劑二甲基三十六烷基銨(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)混合制備結核亞單位疫苗LT70,分別在小鼠模型和家兔模型評價亞單位疫苗LT70免疫學效應及保護效率,并進行BCG初免后亞單位疫苗的強化免疫策略研究。結果:1,LT70融合蛋白在大腸埃希菌E.coli BL21中可溶性表達,應用疏水柱Butyl-FF層析和分子篩G-75的純化方法成功將其分離純化。2,在小鼠模型免疫學評價中,亞單位疫苗LT70誘導產(chǎn)生的抗原特異性IFN-γ水平和抗體Ig G1、Ig G2c水平顯著高于BCG組和PBS組,具有較強的免疫原性。3,疫苗免疫30周后進行結核分枝桿菌H37Rv毒株氣霧攻擊,LT70疫苗顯示出較強的免疫保護力(5.4±0.38 Log10 CFU),其保護效果強于BCG(6.01±0.33 Log10CFU)和PBS組(6.53±0.26 Log10 CFU);BCG初免后亞單位疫苗LT70具有加強BCG的免疫效果(5.62±0.64 Log10 CFU)(p=0.26)。結論:結核亞單位LT70疫苗可誘導較強的抗原特異性細胞和體液免疫應答;在小鼠模型中具有較好的清除和抑制結核分枝桿菌的作用,其保護效果強于BCG,有望成為結核病防治的有效候選疫苗。第三章結核亞單位疫苗DPC佐劑的研究及其應用新型結核亞單位疫苗需要佐劑輔助以誘導較強的免疫應答。選擇適當?shù)淖魟┎粌H提高免疫應答的水平,也可以改變免疫應答的類型。疫苗靶向細胞內(nèi)病原體如結核分枝桿菌,需要誘導細胞免疫應答,包括活化CD4 Th1型輔助T細胞和CD8細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)。然而,當前在臨床上使用的佐劑只有鋁佐劑,該佐劑可促進Th2型體液免疫應答,無法引起Th1型細胞免疫應答。因此,研發(fā)新的可誘導Th1型細胞免疫應答的佐劑對結核疫苗的發(fā)展至關重要。我們在前期研究中,以陽離子脂質體DDA為基礎,聯(lián)合Toll樣受體3激動劑Poly I:C能誘導較強的Th1型細胞免疫應答和較強的免疫保護效果。但是佐劑DDA-Poly I:C(簡稱DP)的穩(wěn)定性較差,易發(fā)生絮凝現(xiàn)象,無法滿足臨床疫苗的需要。目的:我們在佐劑DP的基礎上,研究增強佐劑穩(wěn)定性的方法,以構建更加穩(wěn)定和有效的新型免疫佐劑,利于后期的研發(fā)和生產(chǎn)。方法:1,以佐劑DP為基礎,聯(lián)合不同輔料,通過粒徑和zeta電位等指標評價佐劑的理化性狀和穩(wěn)定性,從而篩選可增強佐劑DP穩(wěn)定性的輔料。2,利用乳化-溶劑揮發(fā)法,將DDA和Poly I:C聯(lián)合膽固醇制成陽離子脂質體佐劑DDA-Poly I:C-膽固醇(簡稱DPC),并與融合蛋白LT70聯(lián)合構建結核亞單位疫苗LT70-DPC。3,在C57BL/6小鼠模型上進行LT70-DPC疫苗的免疫學評價和保護效率評價:0,2,4周進行LT70-DPC疫苗的免疫,末次免疫后6周進行免疫指標的檢測,30周后結核分枝桿菌H37Rv菌株攻擊,攻擊10周后檢測保護效率。結果:1,使用膽固醇聯(lián)合DDA和Poly I:C構建新型疫苗佐劑DPC。2,通過佐劑的理化性狀分析結果顯示新型佐劑DPC較佐劑DP粒徑由約500nm降至約400nm,大小均一;同時,隨著膽固醇的加入,佐劑DP的Zeta電位由23.48(±2.93)升高至41.22(±4.04),佐劑DP的穩(wěn)定性得以明顯提升。3,將佐劑DPC與融合蛋白LT70聯(lián)合,構建結核亞單位疫苗LT70-DPC。通過C57BL/6小鼠模型進行免疫學評價,結果顯示LT70-DPC疫苗和LT70-DP疫苗均可誘導產(chǎn)生較高的抗原特異性IFN-γ水平和抗體Ig G1、Ig G2c水平,其水平顯著高于BCG組和PBS組(p0.05)。4,在小鼠保護效率實驗中,結核亞單位疫苗LT70-DPC具有較強的免疫保護力,LT70-DPC組肺部細菌載量(5.43±0.37Log10 CFU)與疫苗LT70-DP組細菌載量(5.4±0.38 Log10 CFU)相當,均低于BCG組(6.01±0.33 Log10 CFU);同時,結核分枝桿菌H37Rv毒株攻擊后,疫苗LT70-DPC組的病理損傷面積(7.4±0.04%)顯著低于疫苗LT70-DP組(12.2±0.01%)(p0.05)。結論:新型佐劑DPC增加了佐劑DP的穩(wěn)定性,利于后期的研發(fā)和生產(chǎn);結核亞單位疫苗LT70-DPC可以誘導小鼠產(chǎn)生較強的特異性細胞和體液免疫應答;在小鼠保護效率實驗中,疫苗LT70-DPC的保護效果強于BCG,且明顯降低了小鼠肺組織病理損傷,有望成為具有臨床應用價值的有效的結核亞單位疫苗佐劑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33

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5 李s，

本文編號：2474078