【摘要】：小膠質(zhì)細胞是19世紀發(fā)現(xiàn)的繼神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞之后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)第四類細胞。小膠質(zhì)細胞在腦內(nèi)廣泛分布,約占膠質(zhì)細胞總量的5%-20%。目前對于小膠質(zhì)細胞的來源仍存在爭議,廣為接受的學說認為其起源于卵黃囊的血島及血液中的單核細胞。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的免疫細胞,小膠質(zhì)細胞不僅參與神經(jīng)發(fā)生的生理過程,而且在神經(jīng)退行性病變、神經(jīng)損傷以及腫瘤等多種病理過程中發(fā)揮著重要的作用。在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中,靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞為分支狀,胞體小,具有伸向各個方向的細胞突起,用以檢測周圍環(huán)境的變化。靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞具有吞飲功能和一定的遷移能力,可清除代謝產(chǎn)物及神經(jīng)元正常重塑過程中產(chǎn)生的細胞碎片,還可分泌生長因子促進神經(jīng)元的存活。當外源性物質(zhì)入侵,發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷時,小膠質(zhì)細胞立即激活,并發(fā)生明顯的形態(tài)改變：其分支狀突起變粗變短,形成灌木樣,進而胞體變圓、突起消失,成為“阿米巴樣”。阿米巴樣小膠質(zhì)細胞具有較強的吞噬能力,其功能類似于單核巨噬細胞,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮重要的免疫效應。脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS),三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP),p淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, β-APP),低氧,促炎性因子等均可誘發(fā)小膠質(zhì)細胞的激活,引發(fā)瀑布式炎癥反應,導致神經(jīng)損傷的發(fā)生與進展。激活的小膠質(zhì)細胞免疫表型與功能發(fā)生明顯變化。首先,激活的小膠質(zhì)細胞MHCII類抗原表達明顯增加,分泌大量的炎性因子,如白介素-1 (interleukin-1, IL-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子-p(transforming growth factor-β, TGF-p)、前列腺素(prostaglandin, PG)、反應氧簇(reactive oxygen species, ROS)、一氧化氮(nitric oxide, NO)和興奮性氨基酸等。這些免疫效應分子可以通過不同的途徑作用于神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細胞等,直接導致靶細胞的凋亡。炎性因子還可以作用于星形膠質(zhì)細胞,促進星形膠質(zhì)細胞炎性因子的釋放,并反饋性的加劇小膠質(zhì)細胞自身炎性反應的發(fā)生。其次,激活的小膠質(zhì)細胞還可以分泌與遷移相關(guān)的趨化因子,并且上調(diào)表達趨化因子受體,從而介導小膠質(zhì)細胞向損傷部位遷移,加重損傷區(qū)域炎癥反應的進行。與此同時,激活的小膠質(zhì)細胞加速增殖,進一步促進損傷區(qū)域炎癥反應的發(fā)生�？傊�,激活的小膠質(zhì)細胞可以通過以上行為的改變,介導炎癥反應的發(fā)生,從而導致神經(jīng)損傷及疾病的發(fā)生與進展。因此,抑制小膠質(zhì)細胞的激活、減輕炎癥反應,已成為防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個重要策略。只有闡明小膠質(zhì)細胞的激活機制,才能實現(xiàn)針對性的抑制其活化。目前關(guān)于小膠質(zhì)細胞的激活機制研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B (NF-κB),絲裂原蛋白激酶通路(MAPKs)等多個信號通路均有參與,但是其具體的機制仍不清楚。因此闡明小膠質(zhì)細胞激活機制,是實現(xiàn)抗炎治療的前提與研究重點。Notch信號通路在進化上高度保守,結(jié)構(gòu)簡單,是調(diào)控胚胎發(fā)育的重要信號通路。哺乳動物表達四個Notch受體(Notchl-4)和五個配體(Jagged1、2和Delta-like-1、3、4). Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用,Notch蛋白經(jīng)過三次剪切,釋放胞內(nèi)段(intracellular Notch receptor domain, NICD)入胞質(zhì),NICD進而轉(zhuǎn)位進入細胞核,并與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jκ結(jié)合,形成NICD/RBP-Jκ轉(zhuǎn)錄復合體,調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達,發(fā)揮生物學效應。Notch信號通路可以調(diào)控多種器官的發(fā)生。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中,Notch信號通路對神經(jīng)干細胞的增殖分化,成熟神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細胞的功能等都具有重要的調(diào)節(jié)作用。在免疫系統(tǒng)中,Notch信號通路參與T細胞、B細胞以及單核巨噬細胞等多種免疫細胞的功能調(diào)控。值得注意的是,Notch信號通路可以調(diào)控單核巨噬細胞的極化,其過度活化可以導致M1型巨噬細胞的數(shù)量增多,從而引起促炎性因子的大量釋放。如前所述,最廣泛的研究認為小膠質(zhì)細胞來源于卵黃囊的血島及血液中的單核細胞,其功能類似于的單核巨噬細胞,并且目前研究提示Notch信號通路可能參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生,因此,我們推測Notch信號通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞的功能。缺氧性損傷是多種神經(jīng)疾病及神經(jīng)損傷的共同病理特征。發(fā)育中的大腦對低氧尤為敏感,多種原因可能導致胎兒及新生兒的大腦發(fā)生缺氧性損傷。若缺氧發(fā)生在早產(chǎn)兒,易導致腦室周圍白質(zhì)病變(Periventricular damage, PWMD),嚴重者可發(fā)生腦室周圍白質(zhì)軟化(Periventricular Leukomalacia, PLV),從而導致胎兒及新生兒死亡或神經(jīng)發(fā)育異常。其中,小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應在這一病理改變中發(fā)揮重要作用。本課題利用新生大鼠低氧性腦損傷的動物模型,及小膠質(zhì)細胞激活的體外模型,探討Notch信號通路在小膠質(zhì)細胞激活過程中的作用,并分析其作用機制。首先,檢測新生大鼠低氧性腦損傷后Notch信號通路在腦內(nèi)的表達,明確其是否在小膠質(zhì)細胞中表達及損傷后表達量的變化,并利用原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞及BV-2細胞系明確Notch信號通路的表達、激活及對炎癥相關(guān)因子等釋放的影響。其次,利用經(jīng)典的脂多糖刺激誘導小膠質(zhì)細胞活化,觀察Notch信號通路對小膠質(zhì)細胞增殖以及遷移的影響及其機制。最后,我們對Notch信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化的機制進行研究。具體的研究內(nèi)容及結(jié)果如下：第一部分,低氧環(huán)境下Notch信號通路在新生大鼠小膠質(zhì)細胞中的表達及作用。免疫熒光結(jié)果顯示,在低氧性腦損傷的新生大鼠中,胼胝體區(qū)小膠質(zhì)細胞中Notch信號通路的受體Notch-1,配體Delta-1以及Notch-1蛋白活化后形成的活性片段NICD表達增強。其次,在原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞中,利用qPCR及免疫熒光針對Notch-1、Delta-1、NICD,以及NICD在細胞核內(nèi)結(jié)合的分子RBP-Jκ、下游基因Hes-1的表達進行檢測,結(jié)果證實原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞經(jīng)低氧處理后,Notch-1、Delta-1、NICD、RBP-Jκ及Hes-1的表達均增高,說明低氧處理后的小膠質(zhì)細胞中Notch信號通路的表達和激活顯著增強。應用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路,經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)阻斷Notch信號通路后多種炎癥相關(guān)因子的mRNA水平顯著降低。再次,在低氧處理的BV-2細胞系中檢測Notch信號通路的表達及功能。利用qPCR和Western blot對上述Notch信號通路中的分子進行檢測。結(jié)果表明,活化的小膠質(zhì)細胞中Notch-1、Delta-1表達明顯增高,NICD、RBP-Jκ、及下游基因Hes-1表達均增多。應用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路,Western blot結(jié)果顯示小膠質(zhì)細胞內(nèi)炎性因子的釋放顯著降低,且Griess去檢測證實一氧化氮(nitric oxide, NO)釋放量明顯降低。NF-κB信號通路是小膠質(zhì)細胞中介導炎性因子釋放的最主要的信號通路,我們進一步發(fā)現(xiàn)Notch信號通路阻斷后可以抑制BV-2細胞以及低氧損傷大鼠小膠質(zhì)細胞中NF-κB信號通路的激活。這些結(jié)果表明,低氧誘導的小膠質(zhì)細胞活化依賴Notch通路的作用,Notch通路參與低氧調(diào)控的小膠質(zhì)細胞內(nèi)多種炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生。第二部分,Notch信號通路對小膠質(zhì)細胞增殖及遷移的影響。我們利用經(jīng)典的脂多糖刺激誘導小膠質(zhì)細胞活化,觀察Notch信號通路對小膠質(zhì)細胞增殖以及遷移的影響。首先BrdU摻入實驗及流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示Notch信號通路阻斷后小膠質(zhì)細胞的增殖受到明顯抑制,細胞周期發(fā)生阻滯。細胞周期蛋白Cyclin D1表達較激活BV-2細胞明顯降低,而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitors, CDKI) p27kip1的mRNA及蛋白水平均顯著增高。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示Notch信號通路關(guān)鍵基因RBP-Jκ和Hes-1均可以結(jié)合在p27kipl的啟動子區(qū)域,作為負轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控p27kip1的表達。其次,transwell實驗結(jié)果顯示Notch信號通路阻斷后小膠質(zhì)細胞的遷移受到抑制。肌動蛋白F-actin探針檢測發(fā)現(xiàn)F-actin;在活化小膠質(zhì)細胞內(nèi)的重分布受到影響。這些結(jié)果證實Notch言號通路可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的增殖和遷移過程。第三部分,Notch信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細胞激活的分子機制。對Notch信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化的具體分子機制進行探討。首先,Western blot結(jié)果顯示,Notch信號通路阻斷后NF-κB, MAPKs中的p38,INK (c-Jun N-terminal kinase)等多個通路的激活均受到顯著抑制。其次,這些通路激活途徑中的共同分子TAK1的活化明顯降低。K63位特異性泛素化抗體進行western blot檢測,顯示TAK1位置處泛素化水平明顯降低。再次,通過qPCR, Western blot以及免疫染色等發(fā)現(xiàn),Notch信號通路阻斷后,去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白(Cylindromatosis, CYLD)的]mRNA及蛋白水平顯著提高。最后利用染色質(zhì)免疫共沉淀進行研究,發(fā)現(xiàn)Hes-1作為負轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合在CYLD的啟動子區(qū)域調(diào)控CYLD的表達。這些結(jié)果提示Notch信號通路可能通過調(diào)節(jié)去泛素化酶CYLD的表達影響小膠質(zhì)細胞中NF-κB,p-38,JNK等多種關(guān)鍵通路的激活,從而調(diào)控小膠質(zhì)細胞的活化結(jié)論：本課題通過在體動物實驗發(fā)現(xiàn)新生大鼠低氧性腦損傷時,小膠質(zhì)細胞中Notch信號通路的表達增強,并通過體外實驗證實Notch信號通路可介導活化的小膠質(zhì)細胞中炎癥相關(guān)因子的釋放,影響細胞增殖與遷移。因此,Notch信號通路可影響小膠質(zhì)細胞的多種生物學特性。阻斷Notch信號通路可抑制小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應,可能對其參與的神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的防治作用。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
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本文編號：2473390