【摘要】：肺結核是一種具有高傳染性和致死率的疾病。隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用,人們曾經很好地控制了它的傳播,但是近年來,這一疾病再次威脅到人類的健康和生命。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計,最近幾年全世界感染肺結核的人數(shù)在逐年遞增,其中有三分之一感染者死亡�？股氐拇罅渴褂檬窃斐蛇@一現(xiàn)象的主要原因。較長的治療周期和多種抗生素的聯(lián)合使用一方面給病人的身體造成了非常大的傷害,另一方面還導致細菌耐藥性的不斷增強。此外,與艾滋病的交叉感染也是導致其死亡率逐年上升的原因之一。艾滋病病毒會對人體的免疫系統(tǒng)造成傷害,艾滋病患者也就更容易感染肺結核,感染后的患者很難治愈,通常在幾個月后就會死亡。卡介苗(BCG)是預防結核病的唯一疫苗,但是在許多地區(qū)它對結核病的保護力從0到80%不等,對于有免疫缺陷的病人,BCG接種還有可能導致結核的全身播散。因此,人們需要研究開發(fā)更為安全、有效的疫苗來預防結核病的傳播。到目前為止,科學家們也研發(fā)了一些新的肺結核候選疫苗,它們的免疫效果已經通過臨床前的動物實驗證明,個別候選疫苗已經進入了Ⅰ或Ⅱ期臨床實驗,但是這些疫苗都以蛋白或肽作為抗原決定基。與蛋白或多肽疫苗相比,糖綴合物疫苗具有很大的優(yōu)勢：首先,多糖類物質一般都存在于細胞表面,這就可以保證人體在受到細菌感染的過程中能夠快速識別并產生免疫反應；其次,糖的結構具有高度的保守性,不會像蛋白質和核酸那樣容易發(fā)生變異,接種糖疫苗后可能會達到終身免疫的效果；另外,研究證明多糖類物質具有非常重要的生物功能,尤其是在細菌感染人體的最初階段。在許多已經上市的基于糖抗原的疫苗中(如肺炎鏈球菌疫苗、B型流感嗜血桿菌疫苗、C群腦膜炎球菌多糖綴合物疫苗等),糖抗原已經被證明是一種非常重要的抗原組分,因此我們相信基于糖抗原的肺結核疫苗的研究是非常重要的。脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)是結核桿菌細胞表面的一種非常重要的脂多糖。研究證明,LAM在結核桿菌感染人體的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。例如,它能抑制γ-干擾素介導的活化、巨噬細胞活化、觸發(fā)和殺傷活性、T-細胞活化等,這些都和免疫反應息息相關。因此,LAM是研發(fā)肺結核疫苗的良好靶抗原。為此,我們設計了三個源自LAM非還原端的阿拉伯寡糖片段,其結構中都含有α-(1→2)連接的吡喃型甘露二糖。并通過合理的路線設計,以化學手段立體選擇性的合成了這些寡糖半抗原,然后與鑰孔血藍蛋白(KLH)和單磷酰類脂A(MPLA)綴合得到LAM寡糖-綴合物候選疫苗,最后對疫苗的免疫活性進行了初步測試。本論文主要包括以下三個部分：一、對結核桿菌LAM寡糖及其衍生物的合成與性能研究做了詳細的綜述。(1)PIM寡糖的合成。其主要合成思路大體類似,根據(jù)肌醇上六個羥基的反應活性不同,經過合理的保護基策略和路線設計,首先合成特定位置羥基裸露的肌醇衍生物作為受體,然后與不同的甘露糖供體進行糖苷化,最后進行肌醇特定位置的磷酸化得到全保護的PIM衍生物,脫去全部保護基得到終產物。(2)LAM阿拉伯寡糖的合成。阿拉伯寡糖片段中含有α-(1→5)、α-(1→3)以及β-(1→2)等連接方式,其合成也相對比較困難,所以大部分研究主要集中在β-(1→2)連接的阿拉伯糖苷鍵的合成方法學上,主要包括：分子內轉移法、利用構像限制作用選擇合適的保護基、氫鍵誘導法等等。(3)LAM小分子類似物的合成。由于LAM結構的復雜性,其衍生物的合成也是非常困難的,只有少數(shù)人設計合成了非常簡單的分子,且多數(shù)都沒有涉及到β-(1→2)連接的阿拉伯糖苷鍵的構建。二、LAM阿拉伯寡糖-蛋白綴合物的合成。(1)LAM非還原端四糖的合成：該合成以D-阿拉伯糖和D-甘露糖為起始原料,采用[2+2]的糖苷化策略,通過構建甘露二糖供體和阿拉伯二糖受體來實現(xiàn)。在合成阿拉伯二糖時,反應生成α和β異構體的混合物,目標產物通過硅膠柱分離純化,其構型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學位移確定。在合成四糖時也得到了α和β異構體的混合物,產物也可以很容易地通過硅膠柱分離,其構型根據(jù)甘露糖異頭碳的1JCH耦合常數(shù)確定。(2)LAM七糖的合成：該合成采用[5+2]的糖苷化策略,充分利用乙�；泥徎鶇⑴c作用控制立體選擇性,且由于α和β異構體是在合成供體的過程中產生的,避免了在最后階段糖苷化生成異構體,關鍵中間體的構型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學位移確定。(3)LAM十一糖的合成：與七糖的合成類似,該合成采用了[9+2]的糖苷化策略。在合成供體的過程中通過雙糖苷化的方法快速構建分枝型阿拉伯糖苷鍵,整個路線同樣充分利用了乙酰基的鄰基參與作用控制立體選擇性,只有一步反應產生α和β異構體,其構型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學位移確定。(4)寡糖與BSA和KLH的綴合：以雙琥珀酰亞胺戊二酸酯為交聯(lián)劑進行。糖蛋白綴合物的糖含量用硫酸-苯酚法分析計算得到,且BSA綴合物的糖含量可以進一步通過MALDI-TOF質譜確定,KLH綴合物的糖含量通過SDS-PAGE分析確定。(5)LAM寡糖-KLH綴合物的初步免疫結果表明,三個寡糖綴合物均能夠引起特異性的免疫反應,產生一定滴度的抗體。三、LAM阿拉伯寡糖-MPLA綴合物的合成。最初我們計劃將寡糖連接在MPLA的6’-O位置,通過將6’位羥基衍生化引入炔基,接著和含有疊氮基的LAM寡糖經過點擊化學"click"反應完成綴合。我們首先采用收斂的策略高效的合成了6’位羥基的MPLA衍生物,接著和溴丙炔在氫化鈉存在的條件下反應引入炔丙基,但是經過核磁共振二維譜圖鑒定,MPLA4'-O位的磷脂酰基遷移到了6’-O位,而炔丙基被引入到了4’-O位置。后來我們嘗試用戊炔酸與6’位羥基縮合成酯,但是發(fā)現(xiàn)酯鍵穩(wěn)定性較差,容易水解斷開。為了解決這一難題,我們將6’位羥基換成氨基,然后與戊炔酸縮合形成穩(wěn)定的酰胺鍵,接著與LAM四糖經過"click"反應綴合,最后脫去全部保護基得到LAM寡糖-MPLA綴合物。此外,我們還合成了1-O位連接的LAM四糖-MPLA綴合物作為陽性對比。糖脂類化合物的質譜分析一直是令人們頭痛的問題,這類化合物難于離子化,需要通過特殊的質譜條件才能完成。我們采用MALDI-TOF質譜儀對所合成的綴合物進行了質譜分析,其中6’位連接的四糖-MPLA綴合物以2,5-二羥基苯甲酸(DHB)為基質,三氟乙酸(TFA)為離子化試劑,在reflection-負離子模式下分析,1-O位連接的四糖-MPLA綴合物以6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)為基質,檸檬酸銨為離子化試劑,在linear-負離子模式下分析,獲得了滿意的結果。最后,我們還對兩個四糖-MPLA綴合物進行了初步的免疫實驗評價,結果表明它們都能夠引起特異性的免疫反應。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
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本文編號：2459711